本文要點：NIR-II光療劑已成為癌癥早期診斷和精確治療的重要藥物。具有特殊結構和窄帶隙的有機開殼二自由基類化合物因其強烈的自旋耦合效應和近紅外光捕獲能力而成為光療劑的有前景的候選者。然而，考慮到其高化學反應性和自吸收性，實現穩定有效的NIR-II發光二自由基類化合物至關重要，但也頗具挑戰性。在此，通過采用受主平面化/π共軛擴展和施主旋轉策略，成功制備了兩種高度穩定的NIR-II發光二自由基化合物2PhNVDPP和PhNVDPP。在包封到水分散性納米粒子（NPs）中后，2PhNVDPP NPs表現出NIR-II發光、53%的高PCE和改進的光/熱穩定性。2PhNVDPP NPs的體內實驗證明了血管和腫瘤的清晰可視化，以及成功的NIR-II成像引導的腫瘤光熱消融。這項研究不僅開發了一種具有NIR-II發光的開創性穩定的二自由基類光療劑，還為多模式抗癌治療的有效性提供了特殊視角。

活體成像

在此，通過采用包括受體平面化、π-共軛擴展和供體旋轉策略的協同方法，構建了NIR-II FLI引導的癌癥PTT的高度穩定的二己二酸。設計并合成了兩種化合物，即2PhNVDPP和PhNVDPP，它們都具有相同的共面受體，但扭曲的供體結構不同。變溫電子自旋共振（VT-ESR）和密度泛函理論（DFT）表明，這兩種化合物具有開殼二自由基特性。正如預期的那樣，這兩種二羥基化合物都顯示出NIR-II熒光發射，其特征是尾部發射達到1300 nm區域。在將兩種共軛二自由基組裝成水溶性納米粒子（NPs）以提高其生物相容性和生物穩定性后，2PhNVDPP NPs在808 nm下表現出較好的光捕獲能力（1.8×104 M–1 cm–1），理想的NIR-II發光（1013 nm），53%的高PCE和優異的光/熱穩定性。同時，2PhNVDPP NPs顯示出非凡的實時血管系統和腫瘤成像能力。2PhNVDPP NPs在腫瘤中的明顯積累促進了它們在4T1荷瘤小鼠模型中用于NIR-II FLI引導的PTT抗癌治療。這項工作為開發高度穩定的NIR-II發光雙自由基材料，提高癌癥診斷和治療研究的準確性提供了有前景的指導。

圖1. 合成路線和表征

如圖1a所示，精心合成了兩個分子，即2PhNVDPP和PhNVDPP。為了驗證二自由基特征，在d4-1,2-二氯乙烷（C2D4Cl2）中對2PhNVDPP進行了VT 1H NMR測量。隨著溫度從323 K降低到243 K，與芳香環和共軛二烯相關的質子峰（δ=8.49、7.19-7.15、6.68、6.59、6.37和5.39）逐漸變尖和增強（圖1b），表明共軛骨架內的潛在二自由基性質。此外，為了避免分子旋轉在高溫區域表征2PhNVDPP的二自由基性質時產生干擾，在不同濃度下進行了1H NMR測量。在將2PhNVDPP濃度提高到30mM以抑制分子旋轉后，質子峰仍然表現出加寬，揭示了2PhNV的二自由基性質。

為了更好地了解兩種二自由基的自由基物種和自旋多樣性變化，使用相同量的固態每種化合物進行了VT ESR測量（圖1c、d）。固態2PhNVDPP和PhNVDPP的ESR信號表現出2.0030的g因子，表明存在未配對的碳中心自由基。由于2PhNVDPP增強了分子內D-A相互作用，促進了自旋離域并反映了其二自由基特性，因此其ESR信號比PhNVDPP更強。兩個樣品的ESR信號強度的增加與粉末測量結果一致，在2PhNVDPP中表現出更明顯的開殼形式（圖1e）。然而，ESR信號從固體到溶液減弱。因此，這些二自由基性質背后的驅動力可能歸因于共軛誘導的離域能增強和聚集狀態下的分子內運動受限。

圖2. 光物理和光熱特性的表征

獲得了PhNVDPP和2PhNVDPP的紫外-可見近紅外吸收光譜和PL光譜。PhNVDPP和2PhNVDPP的最大吸收峰分別在677和720 nm處測量（圖2a）。與PhNVDPP相比，2PhNVDPP表現出明顯的約43 nm的紅移。這種轉變歸因于四個供體單元的摻入，這增強了分子內D-A相互作用，導致更強的電子自旋離域和2PhNVDPP的更長吸收波長此外，這兩種二自由基類化合物都表現出延伸至1300 nm的NIR-II發射（圖2b）。這一發現有望極大地推動二自由基類化合物在高分辨率近紅外-II FLI研究中的應用。PhNDVDPP的PL光譜顯示出多個發射峰，這可能是由于其溶解度差，在THF溶液中形成了不同大小和形態的聚集體。

為了獲得用于生物應用的水分散NPs，將PhNVDPP和2PhNVDPP封裝在兩親性共聚物基質DSPE-PEG2000中。通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態光散射（DLS）分析證實了PhNVDPPNPs和2PhNVDPP NPs的均勻球形形態，分別顯示平均流體動力學尺寸為57和117 nm（圖2c）。此外，還評估了上述NPs的紫外-可見近紅外吸收和PL光譜。吸收光譜在500-950 nm處顯示出寬的吸收范圍，PhNVDPPNPs的最大吸收波長為DPP NPs和2PhNVDPP NPs分別在595和703 nm處（圖2d）。2PhNVDPP NPs在808 nm處的摩爾吸光系數（ε）為1.8×104 M–1 cm–1，是PhNVDPP NPs（0.29×104 M-1cm–1）的6倍這清楚地表明2PhNVDPP NPs具有顯著強的近紅外光吸收特性，這對于開發新型納米藥物和高性能光療研究至關重要。此外，PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs分別在929和1013 nm處顯示出最大發射峰（圖2e）。PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs的熒光量子產率（QYs）分別為0.05%和0.15%。通過測定QY×ε值來評估NIR-II熒光亮度。2PhNVDPP NPs在850-1500 nm光譜范圍內的亮度值為45.3，是PhNVDPP NPs（16.8）的2.7倍。

利用長波長和優異的光吸收性能，我們研究了含有2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的水溶液在808 nm激光照射下的光熱性能。在808nm激光照射下，純水溶液沒有明顯的溫度變化（圖2f）。值得注意的是，2PhNVDPP NPs水溶液的溫度變化與溶液濃度和808 nm激光的功率密度呈正相關（圖2f，g）。在暴露于808 nm激光（0.5 W cm–2）照射5分鐘后，含有2PhNVDPP NPs（50μM）的溶液的溫度從20.0°C升高到61.5°C，從而有利于其二自由基PTT應用。計算出2PhNVDPP NPs的PCE為53%（圖2h）在808 nm激光照射（0.5 W cm–2）下，含37%PCE的PhNVDPP NPs（50μM）的水溶液溫度從20.1°C升至47.7°C（圖2i）。因此，2PhNVDPP NPs顯示出優異的光熱性能，突出了它們在實體瘤PTT方面的潛力。

阻礙二自由基類化合物更廣泛利用的主要限制是其固有的不穩定性。首先，通過間歇打開和關閉808 nm激光（0.5 W cm–2），以FDA批準的臨床熒光染料吲哚菁綠（ICG）作為對照，評估2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的光熱穩定性。2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs即使在五次加熱-冷卻循環后也保持穩定（圖2j），顯示出優異的光熱穩定性。隨后，在808 nm（0.5 W cm–2）激光照射下研究了2PhNVDPP和PhNVDPP NPs的光穩定性。連續激光照射20分鐘后，PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs的時間依賴性熒光強度沒有明顯變化（圖2k）。然而，ICG中明顯存在明顯的光漂白效應。這些結果表明，PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs溶液顯示出非凡的熒光光穩定性。此外，我們對兩種二自由基類化合物進行了熱重分析，以確定其熱穩定性。2PhNVDPP的熱分解溫度為322°C，高于307°C的PhNVDPP（圖2l）。在與GSH或H2O2孵育不同時間后，2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的吸收光譜僅略有變化，表明其具有相對較好的生物穩定性。同時，在7天的監測期間，它們的粒徑沒有顯著變化。總的來說，這些結果證明了這兩種二自由基在光照射、熱條件和生理環境下的穩定性。

圖3. 體外細胞成像和細胞活力測定

使用HeLa細胞作為模型細胞系研究了2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的細胞成像和亞細胞分布（圖3）。共聚焦激光掃描顯微鏡分析顯示，2PhNVDPP NPs和線粒體染色探針MitoTracker Green之間共定位，Pearson相關系數為0.839（圖3a），突顯了2PhNVDPP NPs對線粒體的顯著靶向能力。此外，探針BODIPY 493/503觀察到PhNVDPP NPs對脂滴的高度特異性，Pearson相關性系數為0.887（圖3b）。

接著進一步研究了2PhNVDPP NPs的體外抗腫瘤性能。最初，在沒有808nm激光照射的情況下，2PhNVDPP NPs的細胞毒性可忽略不計，表明它們對進一步實驗的安全性和適用性（圖3c）。在暴露于NIR激光照射（808 nm，0.5 W cm–2）12分鐘后，觀察到與2PhNVDPP NPs孵育的癌癥細胞的死亡顯著增加。隨著2PhNVDPP NPs濃度從0增加到45μM，細胞存活率從100%降低到16%，表明2PhNVDPP NPs具有有效的抗腫瘤特性。2PhNVDPP NPs的半數最大抑制濃度（IC50）接近28μM。相比之下，即使在45μM和808nm的高濃度激光照射下，使用PhNVDPP NPs也觀察到超過95%的細胞存活率，表明PhNVDPP NPs對腫瘤細胞的光毒性較弱（圖3d）。因此，2PhNVDPP NPs更適合光熱抗腫瘤治療。

此外，我們進行了活/死模擬，以觀察2PhNVDPP NPs的光熱細胞毒性，其中鈣黃綠素AM的綠色熒光表示活細胞，PI的紅色熒光表示死細胞。用2PhNVDPP NPs（50μM）或激光照射（808 nm，0.5 W cm–2）處理12分鐘的細胞僅顯示強烈的綠色熒光，表明對細胞存活率沒有影響（圖3e）。在暴露于2PhNVDPP NPs和激光照射6和12分鐘后，細胞熒光信號逐漸從綠色熒光轉變為紅色熒光，最終在照射12分鐘后通過光療抑制細胞活力。結果表明，2PhNVDPP NPs表現出優異的PTT性能，使其可用于進一步的體內應用。

由于線粒體是2PhNVDPP NPs靶向的亞基，因此檢測了經PTT處理的HeLa細胞的線粒體膜電位（MMP），以研究光熱對MMP的影響。在黑暗中將HeLa細胞與2PhNVDPP NPs和JC-1共培養后，未檢測到MMP的顯著變化。然而，暴露于808 nm激光（0.5 W cm–2）12分鐘導致綠色熒光逐漸增加，綠色與紅色熒光強度的比值增加了1.2倍（圖3f，g）。這一結果表明，PTT誘導線粒體破壞，隨后MMP減少。因此，2PhNVDPP NPs在生物醫學應用方面具有巨大潛力，特別是在近紅外光激活的PTT方面。

圖4. 2PhNVDPP NPs的體內高對比度NIR-II熒光成像和光熱治療

為了評估地拉西烷類化合物的NIR-II成像能力，我們利用2PhNVDPP NPs在裸鼠體內進行了高對比度NIR-II全身血管FLI。該評估涉及砷化銦鎵（InGaAs）探測器與不同長通（LP）濾光片（900、1000、1100和1300 nm）的結合使用。在我們的實驗中，使用808nm激光作為激發光，它可以深入生物組織而不會傷害小鼠。靜脈注射2PhNVDPP NPs后，小鼠腹部血管變得可識別（圖S30）。重要的是，使用LP濾波器在900、1000、1100和1300 nm處捕獲的圖像分別顯示出1.09、1.15、1.26和5.03的SBR依次提高。2PhNVDPP NPs的體內成像結果證明了它們適用于NIR-II二自由基成像。

為了確定體內PTT的最佳治療時間，研究者使用NIR-II FLI研究了2PhNVDPP NPs在4T1荷瘤裸鼠模型中的積累（圖4a）。靜脈注射2PhNVDPP NPs后，腫瘤區域的實時NIR-II熒光強度信號逐漸增加。信號在注射后9小時達到最高熒光亮度，與初始注射相比增加了1.35倍（圖4b）。靜脈注射2PhNVDPP NPs后，小鼠腹部血管變得可識別。重要的是，使用LP濾波器在900、1000、1100和1300 nm處捕獲的圖像分別顯示出1.09、1.15、1.26和5.03的SBR依次提高。2PhNVDPP NPs的體內成像結果。

本文進一步研究2PhNVDPP NPs在FLI引導的PTT在4T1乳腺腫瘤攜帶BALB/c小鼠上的應用，皮下腫瘤體積為100 mm3，作為動物模型（圖4c）。對于2PhNVDPP NPs+L組，腫瘤溫度在2分鐘內從35.2°C迅速升高到44.3°C，隨后穩定在約49.5°C（圖4f），有利于腫瘤消融。相反，在激光照射后，PBS+L組觀察到溫度略有升高（ΔT=3.7°C），表明在沒有2PhNVDPP NPs的情況下光熱效應最小。連續15天每3天測量一次所有組的腫瘤體積和體重。治療15天后采集了腫瘤組織的代表性圖像（圖4e）。PBS、PBS+L和2PhNVDPP NPs組對腫瘤的生長抑制沒有差異。相比之下，對于2PhNVDPP NPs+L組，觀察到幾乎抑制了腫瘤進展，治療后15天內未觀察到復發（圖4g）。此外，在15天的治療期間，各組體重沒有明顯差異，表明2PhNVDPP NPs治療在808 nm激光照射下對小鼠的毒性作用最小（圖4h）。因此，這些結果表明，2PhNVDPP NPs具有作為具有成像和治療功能的光療劑的潛力。

總之，研究者通過采用受體平面化、π共軛擴展和供體旋轉的協同操縱策略，成功制備了高度穩定的NIR-II發光二自由基光致變色劑。通過在DPP受體核心側翼引入共軛二烯并在分子骨架上外部添加4-（N，N-二甲氨基）苯基，合成了兩種創新的二自由基化合物2PhNVDPP和PhNVDPP。這兩種二自由基類化合物都表現出的NIR-II發射，延伸到1300 nm。單晶結構分析表明，共軛二烯DPP受體核的高平面性和分子兩端扭曲供體的空間位阻通過增強自旋離域和抑制分子間π-π堆積效應，共同促成了高度穩定的NIR-II二自由基發光性能。在形成水分散性NPs后，2PhNVDPP NPs表現出增強的NIR光收集能力，在808nm處的摩爾吸光系數是PhNVDPP NPs的6倍。更重要的是，憑借出色的穩定性、良好的生物相容性、53%的PCE和NIR-II發射能力，2PhNVDPP NPs成功地促進了高質量的全身血管和腫瘤成像。此外，2PhNVDPP NPs已被用于NIR-II FLI引導的PTT體內抗腫瘤。據我們所知，據報道，2PhNVDPP是用于成像引導的癌癥治療的具有NIR-II熒光發射的開創性穩定的雙向光鏡劑。這項研究有望激勵研究人員開發穩定的NIR-II發光二羥基化合物，并促進NIR-II二羥基化合物染料在成像引導疾病診斷和治療中的廣泛應用。

參考文獻

Feng L, Tuo Y, Wu Z, et al. Highly Stable Near-Infrared II Luminescent Diradicaloids for Cancer Phototheranostics[J]. Journal of the American Chemical Society, 2024, 146(47): 32582-32594.