本文要點：大多數動脈粥樣硬化血栓事件（例如，腦或心肌梗死）通常是由頸動脈斑塊破裂或侵蝕引起的，因此迫切需要評估斑塊的脆弱性并預測不良腦血管事件。然而，由于沒有足夠的空間分辨率來基于大多數報道的熒光探針對頸動脈進行成像，因此監測細長頸動脈中從穩定斑塊到危及生命的高危斑塊的演變是一個巨大的挑戰。

研究內容：本文報道的NIR-II納米探針是受體-供體-受體-供體-受體（A-D-A′-D-A）分子和給電子單元（D′）共聚，具有高量子產率和良好的穩定性，能夠以足夠的空間分辨率對細長的頸動脈血管進行成像。NIR-II納米探針還可以有效靶向斑塊內巨噬細胞，同時區分活體小鼠頸動脈粥樣硬化中的易損斑塊。NIR-II納米探針可以動態監測頸動脈斑塊中的新鮮出血點。此外，磁共振成像與NIR-II熒光成像相結合，通過將超小的超順磁性氧化鐵加入NIR-II納米探針中，提高細微的結構的對比度。因此，這種混合NIR-II/磁共振成像多模式納米探針為評估頸動脈斑塊負荷、選擇高危斑塊和對斑塊內出血進行成像提供了一種有效的工具，有望降低腦/心肌梗死相關的發病率和死亡率。（Figure.1）

Figure.1

Figure.2

半導體聚合物的合成路線如Fig.2A所示，通過A-D-A′-D-A分子與各種給體單元(即噻吩、苯并二噻吩和二硫苯并噻二唑)共聚，分別合成了3種半導體聚合物，即NIR-1、NIR-2和NIR-3。Fig.2C展示了NIR-1的密度泛函理論分子軌道圖，由于多重ICT，HOMO-LUMO發生分離，使吸收波長延長。作者還研究了這些半導體聚合物在甲苯中的吸收光譜與發射光譜（Fig.2D、E），其中NIR-1顯示出吸收峰與熒光強度。

為了提高生物安全性和血液循環時間，采用納米沉淀法（Fig.2B），通過DSPE-PEG2000將半導體聚合物轉化為半導體聚合物納米顆粒(SPNs)。透射電子顯微鏡(TEM)證實SPNs(NIR-1)大致呈球形(Fig.2H),動態光散射尺寸為43-50nm。如Fig.2 F、G所示，SPNs(NIR-1)、SPNs(NIR-2)和SPNs(NIR-3)的吸收峰分別為780、830和800 nm，并且均表現出較強的熒光發射，其中SPNs(NIR-1)的熒光中心峰。為了研究SPNs的NIR-II熒光性能，使用ICG作為參考，在808 nm激發下， SPNs(NIR-1)表現出熒光強度（Fig.2 I、J）。此外，SPNs(NIR-1) 的熒光強度隨著濃度升高而升高（Fig.2K）。在激光連續照射后，這些SPNs的熒光略有衰減，ICG熒光衰減（Fig.2L）。考慮到SPNs(NIR-1)擁有熒光信號和熒光穩定性，后期實驗選擇了SPNs(NIR-1)。

NIR-II /MRI混合納米粒子的構建。首先，在有機溶劑中采用熱解的方法合成了SPIO納米粒子，然后采用一步式納米沉淀法制備了混合半導體聚合物納米顆粒@超順磁性氧化鐵(SPNs(NIR-1)@ SPIO) （Fig.2B）。使用核磁共振分析儀測量溶液中SPNs(NIR-1)@ SPIO的縱向(r1)和橫向(r2)弛豫，r2/r1比為38.8（Fig.2N）。SPNs(NIR-1)@ SPIO的MR圖像顯示，T2加權MRI信號強度隨著濃度的增加逐漸降低（Fig.2O），而NIR-II圖像顯示，NIR-II熒光信號隨著濃度的增加而增加（Fig.2P）。這些結果表明了SPNs(NIR-1)@ SPIO在雙模態MR和NIR-II熒光成像中的潛力。

Figure.3

接下來作者進行了體內實驗，制備了左側頸動脈粥樣硬化斑塊小鼠模型（AS小鼠）（Fig.3A），HE染色圖像（Fig.3B）顯示，小鼠的左側頸動脈（LCA）中動脈粥樣硬化斑塊局部形成，而右側頸動脈(RCA)保持通暢且無斑塊。注射SPNs(NIR-1)后進行NIR-II熒光成像，LCA的熒光強度高于RCA的熒光強度（Fig.3C），沿其中的紅線RCA和LCA中的熒光強度分布如Fig.3D所示。為了探索頸動脈粥樣硬化斑塊的MRI成像，對AS小鼠靜脈注射SPNs(NIR-1)@SPIO，Fig.3E、F是2個隨機的非連續切片，比較注射前(綠色圓圈)和注射后(橙色圓圈)圖像，發現注射后斑塊中的脂質池(白色箭頭)變得略暗。考慮到巨噬細胞是易損斑塊的靶點，作者探索了巨噬細胞對SPNs(NIR-1)的細胞攝取。使用Cy5.5標記NIR-1制備成得到Cy5.5-SPNs（NIR-1），與巨噬細胞Raw264.7共孵育，發現隨著時間延長，細胞的熒光強度逐漸增強（Fig.3H、I）。此外，還對比了血管內皮細胞（C166），結果表明Cy5.5-SPNs（NIR-1）可以被巨噬細胞而不是上皮細胞有效地攝取（Fig.3J、K）。

Figure.4

作者還進行了NIR-II成像鑒別體內不穩定斑塊的實驗。使用健康小鼠作為對照，分別對動脈粥樣硬化小鼠(AS小鼠)和動脈粥樣硬化合并急性間質性肺炎小鼠(AS小鼠+AIP)的頸動脈斑塊進行了NIR-II熒光成像(Fig.4A)。分析病理特征(Fig.4B)，健康小鼠的無斑塊血管、AS小鼠的動脈粥樣硬化血管變窄和斑塊(綠色虛線)以及AS小鼠+ AIP的斑塊(綠色虛線)中有一個大的軟脂質池(黑色虛線)。肺部HE染色圖像(Fig.4B)、體溫變化曲線(Fig.4C)、中性粒細胞和外周血白細胞（WBCs）計數圖(Fig.4D)均表明LPS處理的小鼠的具有肺部炎癥。

為了測試SPNs(NIR-1)對頸動脈不穩定斑塊進行NIR-II熒光成像的能力，向健康小鼠、AS小鼠和AS+AIP小鼠靜脈注射SPNs(NIR-1)，由NIR-II熒光圖像可知，隨著時間增加，AS小鼠和AS+AIP小鼠的LCA熒光信號逐漸增強(Fig.4E)，從定量結果來看，在注射后120分鐘，AS小鼠+ AIP小鼠的LCA熒光信號分別是AS小鼠或健康小鼠的3倍或15倍(Fig.4G)。 

作者還研究了這些小鼠的血脂水平和炎癥指標，與健康小鼠相比，AS小鼠和AS小鼠+AIP表現出TG和總膽固醇（TC）水平增加，AS小鼠+AIP顯示出比AS小鼠或健康小鼠更低的HDL-C水平，表明膽固醇去除能力降低，這可能導致動脈粥樣硬化病變(Fig.4I)。通過免疫熒光染色檢測了巨噬細胞在頸動脈中的浸潤，發現AS小鼠和AS小鼠+AIP中浸潤的巨噬細胞更多(Fig.4J、K)。

Figure.5

斑塊內出血（IPH）（尤其是頸動脈），被認為是高危斑塊的重要信號，可能導致缺血性中風和血栓性并發癥。為了制備IPH模型，向LCA中的動脈粥樣硬化斑塊微注射小劑量或大劑量的新鮮血液，同時以AS小鼠作為對照組(Fig.5A)。左頸動脈的代表性HE染色圖像證實了新鮮血液局部注入后斑塊內IPH的存在（Fig.5B）。Fig.5C展示了在IPH后1小時向小鼠靜脈注射SPNs(NIR-1)的熒光圖像，Fig.5E、F顯示了不同組在不同時間點的LCA和RCA的熒光強度。從離體圖像來看，AS小鼠+大IPH的LCA熒光強度分別是AS小鼠+小IPH和AS小鼠的1.7倍和4.17倍(Fig.5D、G)。這些結果證明了SPNs(NIR-1)在小鼠中進行IPH NIR-II成像的巨大潛力，并且有利于對易損斑塊進行早期成像并給出預警信號。

總結：作者篩選了一系列具有強吸收/發射的NIR-II熒光聚合物，選擇了一種具有良好的NIR-II熒光QY的熒光聚合物，并將其制備成納米探針。SPNs(NIR-1)顯示了頸動脈血管造影術的NIR-II熒光成像在空間分辨率方面的優勢。此外，作者采用SPNs(NIR-1)通過頸動脈中熒光信號的動態變化來區分易損斑塊與穩定斑塊以及IPH。動脈內熒光強度的局部變化與斑塊的病理特征有很好的相關性。此外，作者通過在NIR-II納米探針中加入超小SPIO效應制備了混合NIR-II/MRI多模式探針，為頸動脈斑塊的空間成像提供了有效工具。因此，這種新型的血管成像平臺可用于早期監測斑塊的病理變化，為監測和早期預警頸動脈高危斑塊提供了有力的成像工具。

參考文獻

Xu, L.; Li, Z.; Ma, Y.; Lei, L.; Yue, R.; Cao, H.; Huan, S.; Sun, W.; Song, G., Imaging Carotid Plaque Burden in Living Mice via Hybrid Semiconducting Polymer Nanoparticles-Based Near-Infrared-II Fluorescence and Magnetic Resonance Imaging. Research 2023, 6.

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