本文要點：急性腎損傷(AKI)具有嚴重的短期或長期并發癥，發病率和死亡率高，對健康構成極大威脅。開發高性能的NIR-II探針，通過NIR-II熒光和光聲雙模成像實現AKI的wu創原位檢測具有重要意義。然而，NIR-II發色團通常具有大共軛性和疏水性，這使得它們無法被腎臟清除，限制了它們在腎臟疾病的檢測和成像中的應用。本文研制了一種具有腎臟清除、水溶性和被激活生物標志物且具有良好光穩定性等特點的探針（PEG3-HC-PB）。該探針的熒光(900 – 1200 nm)由于具有吸電子作用的苯硼基團(響應元件)的存在而猝滅，在830 nm處有一個微弱的吸收峰。但在AKI的腎區存在過表達的H2O2的情況下，苯硼基團被轉化為苯羥基，從而增強了NIR-II熒光發射(900?1200 nm)和吸收(600?900 nm)，最終產生明顯的光聲信號和可用于成像的NIR-II熒光發射。該探針能夠通過對生物標記物H2O2的響應，使用實時3D-MSOT和NIR-II熒光雙模成像技術檢測造影劑誘導的和缺血/再灌注誘導的小鼠AKI。因此，該探針可以作為檢測AKI的實用工具；此外，它的設計策略可以為其他具有多種生物學應用的大共軛NIR-II探針的設計提供借鑒。

背景：急性腎損傷通常有嚴重的短期或長期并發癥，發病率和死亡率高，如果不及時治療，甚至可能成為危及生命的疾病。AKI的準時監測對于及時采取行動防止其發展為更嚴重的并發癥，包括高血壓、急性肺水腫、心律失常和慢性腎臟疾病等至關重要。目前，在醫學實踐中，特定的生物標記物常被用來篩查亞臨床疾病和診斷特定的疾病，因為這些生物標記物在相關疾病的部位經常以異常高的水平過度表達。一些生物標志物不僅存在于疾病部位，而且還存在于其他器官和/或組織中，而一些生物標志物(例如，活性氧(ROS))壽命短，因此在疾病部位對特定生物標志物的非侵入性原位檢測/成像，有望成為準確診斷特定疾病以及揭示與疾病相關的發病機制的理想方法。

近紅外第二窗口(NIR-II，900-1700 nm發射)的熒光成像具有固有的優勢，即組織中的光線散射較弱，自發熒光很少，因此可以以更高的分辨率和更深入的方式實時成像，有助于更準確地診斷疾病和了解疾病的進展。光聲成像方法通過收集樣品中的光吸收劑產生的超聲波，對穿透深度大和分辨率高的樣品進行成像。尤其是，多光譜光聲層析成像(MSOT)通過采用多波長的激光照射樣品來檢測樣品中不同光吸收劑產生的超聲信號；并且通過光譜分解來確定每個光吸收劑的光譜特征，從而可以跟蹤特定光吸收體的光聲信號。同時，其3D(三維)圖像可以很容易地獲取或生成，從而促進疾病部位的準確定位和對其大小的評估。適合NIR-II熒光和光聲雙模成像的探針是非常有用的，因為它提供的信息可以相互驗證。在腎損傷部位，包括H2O2在內的ROS水平升高，導致氧化應激增強，相應地導致組織損傷增加，炎癥加重。腎損傷部位的內源性H2O2可能是一種有前景的原位生物標志物。因此，利用可以進行NIR-II熒光成像和光聲成像的探針，對AKI進行原位檢測，是準確定位AKI的理想方法。

然而，由于腎臟濾過閾值小于6 - 8nm(腎小球濾過屏障)，要達到腎臟可清除的程度，物質必須足夠小，沒有不適當的蛋白質結合導致大聚集體或顆粒。足夠的水溶性有助于減少或避免與蛋白質的結合。因此環糊精或聚乙二醇(n=3?45，聚乙二醇)等親水基團常常用于對一些發色團(或探針)的修飾，使其在近紅外di一窗口發射(近紅外-I，700?900發射)或可見光范圍(Vis，400?700 nm發射)可用于腎臟成像。由于這些NIR-I或Vis發色團(探針)的共軛長度相對較短，因此它們在被親水性基團修飾后通常不會與蛋白質顯著結合。相比之下，用于制備NIR-II成像探針的NIR-II發色團通常具有長共軛和疏水性的結構。這種結構往往導致較差的水溶性，在水生物環境中容易聚集成大顆粒，以及其與蛋白質的非特異性結合，阻礙了這些生色團在腎臟中的清除。由此，為了確保成像探針是腎臟清除的，從而可以用來有效地檢測和成像，探針是水溶的，尺寸小于6?8 nm。

七甲基花菁類染料是一類重要的近紅外發色團，其較易于進行結構修飾以將其熒光拓展到NIR-II波段，且吸收系數高。但它們的長共軛結構和疏水性通常造成其無法被腎臟清除，從而限制了它們在腎臟疾病檢測和成像中的應用。過去的研究試圖通過在染料的兩端引入親水基團來改善這些染料的水溶性，但并不一定會使它們變成腎臟清除。例如，已被FDA批準用于臨床應用的吲哚青綠(ICG)是水溶性的，因為接合結構的兩側都引入了親水磺酸基，但它仍然是被肝臟清除，而不是被腎臟清除；這是因為中間的結合骨架仍然疏水，很容易與體內的蛋白質結合，導致形成的顆粒太大而不能被腎臟清除；采用PEGn(n=3?45)作為親水性基團也是如此，如方案1A所示。

為了充分發揮七甲基菁染料的優點，同時克服其相對較差的光穩定性，開發一種可用于檢測和成像AKI的NIR-II熒光和光聲雙模成像探針，本研究設計了具有腎臟清除、水溶性和生物標志物可激活且具有良好光穩定性的PEG3-HC-PB探針。該探針的設計策略包括以下三個方面：(1)在兩端和中間引入三個親水和生物相容的PEG3基團(方案1B)，將疏水的共軛骨架分段，從而確保水溶性，避免與蛋白質結合；(2)在中心環己烯基的底部和頂部分別引入叔丁基和酰胺基(方案1B)，導致空間位阻增加，共軛骨架的電子密度降低，防止染料因親電攻擊而光漂白；(3)將反應元件(苯基硼酸基)引入中心部分，開發了生物標志物可激活探針(PEG3-HC-PB)，用于H2O2原位反應NIR-II熒光和光聲雙模成像檢測小鼠AKI(方案1B)。該探針的熒光(900?1200 nm，峰值位于950 nm)由于吸電子的苯硼基團的存在而被猝滅，在830 nm處有一個較弱的吸收峰。但在AKI的腎區存在過表達的H2O2的情況下，苯硼基團被轉化為苯羥基，從而增強了NIR-II熒光(900?1200 nm)和吸收帶(600?900 nm)，最終產生明顯的NIR-II熒光信號和光聲信號用于成像。該探針能夠通過對生物標記物H2O2的響應，使用實時3D-MSOT和NIR-II熒光雙模成像技術檢測造影劑和缺血/再灌注誘導的小鼠AKI。

Scheme 1

實驗內容：

1）PEG3-HC-PB探針的合成及性能研究。

完成探針PEG3-HC-PB和生色團PEG3-HC-POH(理論上是PEG3-HC-PB與H2O2反應的產物)的合成后，首*行蛋白吸附試驗，以確認水溶性的探針和生色團是否與蛋白發生非特異性結合并形成聚集體，影響腎臟對其的清除。實驗結果表明。探針和發色團對蛋白質的吸附很低，這可能是因為長的結合骨架被位于兩端和中間的三條生物兼容的PEG3鏈分割。

由于探針PEG3-HC-PB是水溶性的，所以在pH 7.4的PBS中測試了它的光譜性質和對H2O2的響應。圖1A，B顯示，隨著H2O2水平的增加，PEG3-HC-PB探針在900?1200 nm范圍內的熒光強度增強(峰值發射在950 nm)；而在沒有H2O2的情況下，其熒光相當弱。隨著探針PEG3-HC-PB與H2O2反應時間的延長，熒光強度相應增加，并在35分鐘左右達到平衡。圖1C顯示了探針PEG3-HC-PB在沒有或有H2O2的情況下的吸收光譜，很明顯，隨著H2O2劑量的增加，在600?900 nm處的吸光度增加(峰值吸光度在830 nm處)。接著測量用不同劑量的H2O2處理探針PEG3-HC-PB后的光聲信號，在680?900 nm范圍內，光聲信號在約830 nm處，且光聲信號隨著H2O2劑量的增加而增加（圖1D）。以上結果表明，PEG3-HC-PB探針能夠有效地響應H2O2，從而發出明顯的光聲信號以及用于H2O2檢測的NIR-II熒光信號。

接著使用808 nm激光(250 mWcm?2)連續照射60min，考察探針PEG3-HC-PB與H2O2以及生色團PEG3-HC-POH孵育后的光穩定性。如圖1E所示，與H2O2和發色團PEG3-HC-POH孵育后的探針PEG3-HC-PB較IR808和ICG具有更好的光穩定性。探針PEG3-HC-PB與H2O2或發色團PEG3-HC-POH孵育后，即使在連續激光照射60min后，也只顯示出輕微的熒光信號損失，而ICG和IR808被快速光漂白，表明該探針和發色團具有良好的光穩定性。良好的水溶性、低蛋白質結合率、良好的光穩定性以及對H2O2的響應都證明了該探針設計策略的有效性。

實驗測試了該探針對H2O2響應的選擇性和抗干擾性。為此目的，分別加入H2O2 (140 μM)或其他生物相關和潛在的干擾物質(半胱氨酸、谷胱甘肽、L-異亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、丙氨酸、葡萄糖、精氨酸、NaNO2, Na+ , K+ , Ca2+, Mg2+, NaClO, and ONOO?) 35min后，測量其在950 nm處的熒光強度。圖1F顯示，在探針(20 μM)與H2O2 (140 μM)反應時，熒光顯著增強。相比之下，探針與其他物質的反應只產生微弱的熒光強度。此外，這些物質中的每一種與H2O2共存對探針對H2O2的熒光強度幾乎沒有任何影響。在加入H2O2 (65 μM)和其他每種物質的情況下，也測量了探針(10 μM)的光聲信號。實驗結果顯示，只有在探針(10 μM)與H2O2 (65 μM)反應后，光聲信號才明顯增強，而探針與其他物質反應后僅能觀察到輕微的光聲信號。這些物質中的每一種與H2O2共存對探測器在光聲信號方面對H2O2的響應沒有影響。這些實驗結果表明，探針PEG3-HC-PB可以作為一種H2O2激活的顯像劑，具有明顯的熒光信號和光聲信號，且對H2O2的響應具有良好的選擇性和抗干擾性。

為了確定探針PEG3-HC-PB對H2O2的反應機理，如方案1B所示，記錄了探針溶液與H2O2反應后的吸收光譜和熒光光譜，并與合成的生色團PEG3-HC-POH進行了比較。可以看到吸收光譜和熒光光譜非常相似，表明探針PEG3-HC-PB與H2O2反應后轉化為生色團PEG3-HC-POH。進一步通過高效液相色譜和HR-MS的數據進行驗證，如圖1G所示，探針與H2O2反應后在保留時間5.83分鐘出現一個新的峰，與發色團PEG3-HC-POH一致，而保留時間為2.71分鐘的峰減少，與探針Peg3-HC-PB一致，證實了PEG3-HC-PB與H2O2反應后已轉化為PEG3-HC-POH。此外，還進行了HR-MS測量，對于與H2O2反應后的探針PEG3-HC-PB(圖1H)，明顯地在m/z 1150.6726處出現了與PEG3-HC-POH([M]+)相匹配的新峰。這些數據證實了H2O2裂解PEG3-HC-PB中的硼酸基(識別元件)，最終產生生色團PEG3-HC-POH。

在進行動物實驗前，對PEG3-HC-PB探針的生物安全性進行了評價。實驗組小鼠由尾靜脈注射溶于生理鹽水的探針PEG3-HC-PB，對照組為健康小鼠，比較對照組和實驗組兩組小鼠體重的差異。結果表明兩組小鼠的體重沒有明顯差異。采用HE染色對兩組小鼠的主要臟器組織進行組織學分析，對照組和實驗組之間的差異不大。對于激活的探針PEG3-HC-POH，血液循環半衰期約為75分鐘。活化的探針主要在5h內在腎臟內蓄積，并在靜脈注射后24h內被清除。此外，還測定了健康小鼠在靜脈注射24小時后對PEG3-HC-PB探針的腎清除效率，約為83%。這些數據證實了探針PEG3-HC-PB具有良好的生物安全性，適合于體內生物成像。

Figure  1

2）造影劑誘發小鼠急性腎損傷的影像研究。

首先嘗試應用PEG3-HC-PB探針在小鼠體內檢測造影劑DTZ誘導的AKI。DTZ在臨床上用于尿路造影，由于其被腎臟清除，經常引起包括腎小管上皮細胞毒性和腎臟血流動力學改變在內的不良反應，造成急性腎損傷。H2O2在各種AKI的發生發展中起重要作用，并且在AKI時的腎區過度表達，可以作為AKI的內源性原位生物標志物。按文獻報道的方法靜脈注射不同濃度的DTZ建立AKI小鼠模型。如圖2A所示，小鼠靜脈注射DTZ后24小時，靜脈注射探針PEG3-HC-PB，對小鼠進行NIR-II熒光成像和MSOT成像實驗。如圖2B、C所示，在NIR-II熒光圖像中，由于腎臟代謝的原因，腎區的熒光信號在注射探針后約5小時內增加，然后減弱，直至24小時消失。隨著DTZ劑量的增加，NIR-II熒光信號增強，DTZ水平越高，腎臟損傷越嚴重。圖2D顯示，與對照組(健康小鼠組)相比，模型小鼠的腎臟隨著DTZ劑量的增加而變得蒼白和腫脹(水腫)。這些結果再次提示DTZ可引起AKI，且腎臟損傷隨DTZ劑量的增加而加重。此外，圖2E顯示了注射探針PEG3-HC-PB后5小時各組小鼠主要器官(包括心、肺、肝、脾和腎臟)的NIR-II熒光強度；圖2F顯示了不同組小鼠主要器官的NIR-II熒光圖像，其中腎臟的熒光信號較強，且腎臟的熒光強度隨DTZ劑量的增加而增強，這與體內NIR-II成像數據一致。此外，與對照組(健康小鼠)相比，隨著DTZ水平的增加，小鼠的體重出現了更明顯的下降，進一步證實了DTZ對腎臟的毒性。

Figure  2

接著用探針PEG3-HC-PB通過MSOT成像檢測造影劑(DTZ)誘導的AKI。圖3A、B顯示了靜脈注射探針PEG3-HC-PB后不同時間記錄的小鼠MSOT橫斷面圖像。與正常對照組(即健康小鼠組)相比，在靜脈注射探針5h后，模型組小鼠腎臟MSOT信號增強，DTZ水平升高(圖3A)。MSOT成像結果顯示，在注射PEG3-HC-PB探針后，腎臟MSOT信號增強，并在5h時并達到峰值，隨后由于腎臟代謝的原因，MSOT信號減弱。接著，為了從不同的角度證實對比劑DTZ誘導的AKI，用肌酐測定試劑盒和尿素測定試劑盒測定了小鼠的SCR和BUN。給予較高劑量DTZ的小鼠，SCR和BUN水平均明顯高于對照組(健康小鼠)（圖3C，D）。此外，從三組小鼠靜脈注射探針PEG3-HC-PB(圖3E)后覆蓋部分小鼠軀干的3D-MSOT圖像可以明顯看出，接受高劑量DTZ的小鼠腎區MSOT信號比對照組強得多（圖3E）。顯然，這些MSOT成像結果與NIR-II熒光成像數據具有很好的一致性。上述結果也證實了DTZ劑量越大，腎損傷越嚴重。

然后對各組小鼠的主要臟器進行MSOT成像。與其他器官相比，注射DTZ的模型鼠腎臟的MSOT信號要明顯得多。對不同組小鼠腎組織切片的進行組織學分析，圖3F中的H&E染色圖像顯示，與對照組(健康鼠)相比，模型組小鼠腎小管擴張和空泡化變性。DTZ高劑量組腎臟損害較低劑量組明顯加重，進一步證明造影劑確實對腎臟有損害，且隨著造影劑劑量的增加，腎損傷程度加重。

Figure  3

3）小鼠腎缺血/再灌注性急性腎損傷的影像研究。

在小鼠腎缺血/再灌流(I/R)所致急性腎損傷模型中進一步驗證PEG3HC-PB探針的應用。腎I/R損傷是AKI的一種(主要臨床癥狀是快速腎功能障礙，發病率和死亡率高)。在腎I/R損傷時，腎臟過度產生H2O2，從而導致局部炎癥和細胞凋亡加劇，進一步加重腎臟損傷。利用PEG3-HC-PB探針，通過對腎臟內源性H2O2的反應來檢測I/R導致的AKI。采用3組小鼠，其中1組為對照組(健康小鼠行無缺血的中線切開手術)，2組為模型組(即健康小鼠通過夾閉雙側腎蒂造成不同時間(30或60min)的缺血，然后再灌流24 h)。圖4A顯示了腎臟I/R損傷的過程和雙模成像實驗。在腎缺血/再灌流誘導的AKI小鼠模型的外科手術過程中，在缺血30或60分鐘后，腎臟的顏色由血紅變為深紫色，然后在血液再灌流時又恢復為紅色(去除血管夾后)。

圖4B、C的NIR-II熒光圖像和熒光強度顯示，在注射PEG3-HC-PB探針后5h，對照組腎臟區域幾乎沒有熒光，而模型組腎臟區域有明顯的熒光信號。與缺血時間短(缺血時間30min，再灌注時間24h)相比，缺血時間長(缺血60min，再灌流時間24h)組的熒光信號更明顯，這可能是由于缺血時間較長(60min)，導致腎臟產生更多的H2O2，從而導致更嚴重的腎損傷。圖4D顯示了每組小鼠器官(包括心、脾、肝、肺和腎)在靜脈注射探針PEG3-HC-PB后5小時的NIR-II熒光圖像，其NIR-II熒光強度如圖4E所示。從這些圖中可以看到，在主要器官中，腎臟的熒光信號要強得多，并且隨著缺血時間的增加，熒光強度也增加，這與NIR-II活體成像數據是一致的。如圖4F所示，與對照組相比，缺血60分鐘的模型小鼠的腎臟變得蒼白，并有明顯的水腫。這些數據表明，增加缺血持續時間會加劇AKI。此外，與對照組相比，隨著缺血時間的延長，小鼠的體重下降更加明顯，這進一步證實了隨著缺血時間的延長，腎臟缺血?再灌注損傷變得更加嚴重。

Figure  4

繼續，利用探針PEG3-HC-PB對腎I/R損傷進行MSOT成像檢測和成像。圖5A、B為小鼠靜脈注射PEG3-HC-PB后不同時間段的MSOT橫斷面圖像。與對照組相比，在靜脈注射探針PEG3-HC-PB后5 h，模型小鼠腎區出現明顯的MSOT信號(圖5A)。采集靜脈注射PEG3-HC-PB后不同時間的MSOT圖像。MSOT成像結果顯示，在注射探針PEG3-HC-PB后，腎區MSOT強度增強，約5h達到峰值，隨后由于腎臟代謝作用，MSOT強度緩慢減弱(圖5B)。通過商業試劑盒(肌酐和尿素分析試劑盒)檢測每組小鼠的SCR和BUN水平，進一步證實了I/R誘導AKI的可靠性。如圖5C，D所示，缺血時間較長的小鼠，SCR和BUN水平均明顯高于對照組，且缺血時間越長，腎臟損傷越嚴重。從三組小鼠靜脈注射探針PEG3-HC-PB后覆蓋部分小鼠軀干的3D-MSOT圖像(正交視圖圖像)(圖5E)也可以明顯看出，缺血時間較長的小鼠腎區MSOT信號明顯強于對照組。

然后對三組小鼠的主要器官進行MSOT成像。模型組(缺血時間為30或60分鐘，再灌注時間為24小時)小鼠腎臟的MSOT信號較其他器官強，且隨著腎臟缺血時間的增加，MSOT信號逐漸增強。這與體內影像學觀察一致，腎缺血時間越長，腎損傷程度越重。對三組小鼠的腎組織切片進行組織學分析，如圖5F所示。在H&E染色圖像中，與對照組相比，缺血時間較長組(60min)和缺血時間較短組(30min)均有明顯的腎小管擴張和空泡化變性。并且，缺血時間越長(60min)，腎臟損害越嚴重。以上結果都證實腎臟I/R確實可引起腎臟損傷，且缺血時間越長，急性腎損傷程度越重。

Figure  5

結論：本研究設計的PEG3-HC-PB探針具有良好的光穩定性、水溶性、腎臟清除性和生物標記物的活性，可用于通過NIR-II熒光和MSOT雙模成像的技術檢測活體AKI。

在AKI的情況下，腎臟中病理水平的H2O2激活探針PEG3-HC-PB，導致發色團PEG3-HC-POH的釋放，并相應地釋放強烈的NIR-II熒光信號和光聲信號。該探針已被用于檢測造影劑(DTZ)和腎臟腎缺血/再灌注誘導的小鼠AKI，可作為MSOT和NIR-II熒光雙模成像檢測和監測AKI的可操作工具。此外，3D-MSOT圖像可以以時空方式用來定位疾病部位。這一策略可能為設計響應其他生物標志物的基于七甲基花菁的NIR-II探針以及設計其他用于疾病成像應用的NIR-II探針提供新的視角。

參考文獻

Zeng, C., Tan, Y., Sun, L., Long, Y., Zeng, F., & Wu, S. (2023). Renal-Clearable Probe with Water Solubility and Photostability for Biomarker-Activatable Detection of Acute Kidney Injuries via NIR-II Fluorescence and Optoacoustic Imaging. ACS Appl Mater Interfaces, 15(14), 17664-17674.

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