本文要點：近紅外II（NIR-II）光學窗口中的熒光發射可減少自發熒光和光散射，使疾病檢測和手術導航的深部組織可視化。小分子NIR-II染料是臨床生物成像應用的首xuan，因為其分子合成的靈活性允許精確控制其光學和藥代動力學特性。在各種類型的染料中，基于供體-受體-供體（D-A-D）染料表現出優異的光穩定性，而常用的PEG化方法由于其固有的自組裝效應，在水環境中不能保持足夠的固有亮度。本文證明了市售表面活性劑可以作為分散劑來防止PEG化D-A-D染料的分子聚集。由于D-A-D染料和表面活性劑之間共組裝的有利能量，形成的表面活性劑-修飾染料策略顯著提高了染料亮度。因此，這種方法為體內生物成像應用提供了顯著的改進性能。同時，本文還研究了小鼠模型肝臟中的D-A-D染料攝取和信號增強特性，并證明腔內的Kupffer細胞可以潛在地分解PEG化的D-A-D聚集體，從而恢復其固有的亮度。

背景：與在可見光/NIR-I光譜區域發射熒光的傳統熒光團相比，近紅外-II（NIR-II）小分子染料成像具有更大的穿透深度，低自發熒光和相對較低的生物毒性，因此可以獲得對比度更高的圖像。由于NIR-II熒光發射熒光團通常具有延伸的疏水π共軛基團，染料需要用額外的親水基團包括烷基磺酸鹽、烷基羧酸鹽和聚乙二醇（PEG）分子及其眾多衍生物進行改性，以賦予水溶性和生物生物相容性。當前NIR-II熒光基團從油相過渡到水相時的熒光猝滅仍然是其成功進入臨床的主要障礙。這種亮度損失歸因于聚集引起的淬滅（ACQ）現象效應。NIR-II熒光D-A-D染料表現出優異的光穩定性，從而消除了實施時光漂白的任何擔憂。為了提高亮度，通常使用PEG分子，因為它們可以用作屏蔽單元（S），能夠調節NIR-II熒光S-D-A-D-S染料的量子產率和藥代動力學特性。據推測，廣泛的PEG化可以改變S-D-A-D-S染料的溶解度，使它們轉化為兩親性分子，因此本質上傾向于自組裝。這種不可避免的聚集效應是所有先前報道的NIR-II D-A-D染料的常見問題。即使在非常低的濃度下，這些染料的自組裝淬滅行為也可能發生。本文合成了兩種S-D-A-D-S小分子染料，作為研究分子間組裝和隨后的NIR-II熒光發射的淬滅的模型系統。合理的供體替代提高了S-D-A-D-S熒光團的NIR-II量子產率。發現商業表面活性劑可有效防止我們制備的PEG化S-D-A-D-S染料的聚集/自組裝。因此，表面活性劑修飾的S-D-A-D-S染料在水溶液和體內成像中的量子產率顯著提高。

研究內容：1、通過合理的供體取代設計合成D-A-D分子：文獻報道，許多NIR-II熒光團的S-D-A-D-S結構具有特殊的光穩定性，從而為長時間的體內成像應用提供生物事件的長期可視化潛力。近年來，供體基團的烷基異構化備受關注。這種對受體電子的整體電子離域進行供體特異性修飾并進一步增強發射波長的想法最近也引起了研究人員的興趣。然而，這種調整也降低了分子扭曲角。這可能導致電荷轉移特性降低，從而強調非常強的受體效應，最終導致更強的組裝淬滅趨勢。為了進一步證實這些猜想，作者設計并合成了一對S-D-A-D-S結構異構體（Figure.1a），IR-FH4和IR-FH3。高斯計算表明，在4C位上取代烷基的IR-FH4具有較小的光學帶隙和基態二面角（Figure.1bc）。結果表明，4C染料在基態上的二面角較小，表明該結構的電子結構更加離域。BBTD和噻吩在4C染料中的二面角僅為0.8°，導致了更長的吸收、發射波長，以及更高的熒光量子產率。然而，熒光光譜表征顯示，與DMSO相比，IR-FH4P的水溶液減少了20倍（Figure.1d）。與DMSO相比，吸收光譜在水溶液中也顯示出強烈的藍移（Figure.1e）。

Figure 1

2、商業表面活性劑有效地克服了PEG化S-D-A-D-S染料的固有聚集/組裝：使用透射電子顯微鏡（TEM）表征，作者驗證了IR-FH4P在溶解在PBS緩沖液中時固有地形成相對較大的納米顆粒（約80 nm）（Figure.2a）。相反，它很好地分散在有機溶劑中，例如氯仿。基本上，IR-FH4P形成大的球形納米顆粒，導致在水環境中熒光猝滅。即使在非常低的濃度下，D-A-D熒光近紅外染料仍然形成納米顆粒的聚集/組裝。然而，IR-FH4P供體基團的異構化通過減小結構扭曲角放大了這種聚集/組裝效應。在D2O和 DMSO-D2O系統中IR-FH4P的典型化學位移隨著峰寬的增加而大大減弱，與CDCl3中可預測的精確信號相反(Figure.2c）。這種現象與以往大環分子和聚集體誘導發射（AIE）分子的自組裝一致，表示IR-FH4P的聚集特性。隨著對熒光猝滅和分子聚集之間關系的廣泛理解，它促使我們通過利用表面活性劑等增溶技術來解決這一緊迫的挑戰。因此，我們采用了一種常用的表面活性劑Triton-X100（Triton）來分解IR-FH4P納米顆粒。DLS數據顯示，Triton-X100修飾的IR-FH4P經歷了中間狀態（DLS測試中的大直徑），最終轉變為流體動力學直徑約8 nm的拆卸狀態，類似于其在有機相中的完quan溶解狀態（Figure.2e）。繪制七種不同濃度的 IR-FH4P 和 Triton-X100 混合物的 DLS 大小，使我們能夠確定在水溶液中完quan分解IR-FH4P的zui低Triton-X100濃度（0.1% w/w）（Figure.2f）。

Figure 2

為了進一步驗證該策略的可行性，同時使用了五種常見的表面活性劑來測試亮度增強。與實驗設計一致，作者發現大多數測試的表面活性劑，包括陰離子、陽離子和非離子表面活性劑，都能有效提高IR-FH4P的NIR-II亮度，恢復到與其有機相對應物相同的亮度水平（Figure.3a）。值得注意的是，當添加等量的Triton-X100時，異構體IR-FH3P僅表現出3倍的亮度增強，這表明對不同S-D-A-D-S結構使用表面活性劑的溶解度存在差異，結構優化是必要的（Figure.3b）。為了研究表面活性劑和染料體系的分解機理，作者通過IR-FH4P與三種典型表面活性劑混合測試了一組樣品的尺寸演變（Figure.3c）。正如預期，表面活性劑修飾染料優先在較低的表面活性劑濃度下形成共組裝的納米顆粒，而當不含表面活性劑時，它們基本上無法在水溶液中自組裝。從DLS（Figure.3d）的結果來看，隨著DMSO-PBS混合溶液中DMSO含量的變化，染料聚集體的粒徑表現出與梯度濃度表面活性劑體系相似的變化趨勢。由于表面活性劑通常對生命系統有毒，作者接下來使用純染料，純表面活性劑和染料/表面活性劑混合物進行了細胞毒性實驗。結果表明，在等效給藥劑量下，染料/表面活性劑混合物的毒性明顯低于單一表面活性劑（Figure.3ef）。染料/表面活性劑探針的毒性顯著降低，進一步證明了表面活性劑和IR-FH4P共組裝成穩定的伴侶，從而消除了其在體內應用的毒性問題。為了進一步確認該策略的低毒性，通過蘇木精和伊紅（H&E）染色對生理鹽水，IR-FH4P和IR-FH4P / Triton給藥的小鼠的肝臟進行病理分析也驗證了沒有明顯的異常形態（Figure.3g）。

Figure 3

3、表面活性劑修飾的S-D-A-D-S染料在體內顯著增強了NIR-II的亮度我們靜脈注射表面活性劑修飾的IR-FH4P和不含表面活性劑的IR-FH4P以比較它們的體內性能，以評估表面活性劑修飾的染料在體內的增強亮度（Figure.4ab）。IR-FH4P/Triton-X100 組的 NIR-II 信號在短時間內遠高于不含表面活性劑的IR-FH4P 組（IR-FH4P/Triton-X100 型號在 60 秒時間點增強約 12 倍）。無表面活性劑的IR-FH4P注射組的肝臟和皮膚/肌肉信號隨著時間的推移而增加，并在24小時時間點達到與IR-FH4P / Triton-X100組相同的范圍（Figure.4c-f）?？偟膩碚f，表面活性劑修飾的IR-FH4P在24h內提供了顯著的亮度增強，這可能是解決NIR-II熒光發射S-D-A-D-S染料固有的分子間聚集和熒光猝滅問題有希望的策略。

Figure 4

4、表面活性劑修飾的NIR-II熒光團可實現高效腫瘤和淋巴結成像：在建立了表面活性劑修飾染料策略的體內生物成像能力后，作者研究了IR-FH4P和IR-FH4P / Triton-X100是否可以在小鼠模型中提供高效的淋巴結（LNs）成像。為此，將剃光的Balb / c小鼠主要用于腘窩和骶部LNs成像。在右腳墊上皮內注射IR-FH4P / Triton-X100混合物（100μM，25μL），同時在左腳墊上注射等效染料劑量的不含表面活性劑的IR-FH4P。如Figure.5ab所示，顯然記錄了非常不同的NIR-II熒光強度，并且在前30分鐘內使用IR-FH4P / Triton-X100和不含表面活性劑的IR-FH4P之間大約有3倍的亮度增強。作者還研究了IR-FH4P / Triton-X100染料在LN成像中是否保持了D-A-D染料出色的光穩定性。在PBS和IR-FH4P / Triton-100X混合物中皮內注射等效劑量的ICG（OD808nm=0.5），并通過上述相同條件進行比較（Figure.5cd）。左側注射ICG的NIR-II信號在前30分鐘內迅速減弱，而右側注射的IR-FH4P/Triton-X100的LN信號保持一致。接下來，作者用靜脈注射IR-FH4P / Triton-X和不含表面活性劑的IR-FH4P對兩組4T1腫瘤小鼠的腫瘤進行了成像。將兩組腫瘤信號與注射后時間做對比，發現與不含表面活性劑的IR-FH4P注射組相比，IR-FH4P / Triton-X100的峰值積累延遲很多（72小時與24小時）（Figure.5e）。值得注意的是，注射IR-FH4P / Triton-X100組表現出約2倍的信肌比增強（Figure.5f）。

Figure 5

5、NIR-II S-D-A-D-S熒光基團在肝臟和Kupffer細胞中的熒光增強機制：和以前的報告反復觀察到，靜脈內施用一系列PEG化的S-D-A-D-S熒光團后，肝臟信號逐漸增加。以前的報道將這種現象完quan歸因于它們的大尺寸和長血液循環。上述表面活性劑修飾策略促使作者重新確定這些歸因，因此作者認為巨噬細胞也可能分解S-D-AD-S熒光團（這將導致其NIR-II亮度增強）。在這種情況下，隨著時間的推移，肝臟中的信號增強大致可以分為兩個階段：熒光團積累階段和熒光團分解階段。這兩個階段都可以增強肝臟中積累的熒光團的NIR-II熒光信號。在di一階段，游離染料在循環時積聚在肝臟（例如Kupffer細胞）中，從而產生一定的亮度增強。染料在第二階段被Kupffer細胞進一步分解，肝臟顯示出進一步增強的熒光信號（Figure.6a）?；谶@一假設，Kupffer細胞（位于肝腔內的主要巨噬細胞）用于體外檢查其對IR-FH4P和IR-FH4P / Triton的分解性能。通過培養KCs并用IR-FH4P孵育一組典型周期（1，3，6，12，24，48，72小時），對胰蛋白酶化和收集的KCs進行NIR-II亮度測試（Figure.6b）。定量信號隨孵育時間增加，與相應時間點靜脈注射IR-FH4P后的肝臟信號呈正相關（Figure.6cd）。為了進一步探索分解機制是否完quan依賴于活細胞，將KCs和4T1細胞的細胞裂解物與等效的IR-FH4P一起孵育一段時間（Figure.6e）。染料孵育細胞裂解物的NIR-II熒光強度與純裂解物緩沖液（CeLytic M）中的染料相似，表明增強完quan是由純裂解物緩沖液中的表面活性劑成分引起的（Figure.6f）。

Figure 6

總結：作者設計并合成了一對NIR-II S-D-A-D-S染料，并研究了噻吩接頭C3和C4位的烷基鏈取代對其熒光特性的影響。作者發現，與常用的C3位取代相比，在噻吩供體的C4位取代的烷基具有更好的量子效率。表面活性劑修飾的S-D-A-D-S染料的NIR-II亮度增強能夠顯著改善成像對比度，特別是在較短的成像窗口內。在短期內，表面活性劑修飾的IR-FH4P在體內應用中與不含表面活性劑的IR-FH4P組相比，提供了3至10倍的熒光增強。對于淋巴結定位應用，該策略提供了更高的成像對比度（3倍增強）。使用這種策略，S-D-A-D-S染料被迫與表面活性劑共組裝以防止分子間聚集。此外，與等量的表面活性劑相比，表面活性劑修飾染料系統顯示出很低的細胞毒性，從而消除了體內生物成像的毒性問題。

參考文獻

doi.org/10.1039/d2sc05651h

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