本文要點:前列腺特異性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原發性和轉移性前列腺腫瘤細胞膜上過表達的一種II型跨膜糖蛋白,PSMA的表達水平與前列腺癌分期和Gleason評分呈正相關,因此,PSMA可作為一種評估PCa(前列腺癌)的有效生物標志物。
現如今盡管已經開發出幾種治療前列腺癌的藥物,前列腺切除術仍然是不錯的治療方法和早期患者可選擇的辦法,但是前列腺癌(PCa)由于其復雜的解剖結構,在保留癌旁組織的同時對腫瘤進行精確切除是一個挑戰。前列腺特異性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原發性和轉移性前列腺腫瘤細胞膜上過表達的一種II型跨膜糖蛋白,PSMA的表達水平與前列腺癌分期和Gleason評分呈正相關,因此,PSMA可作為一種評估PCa(前列腺癌)的有效生物標志物。近年來已經開發出了一些針對前列腺特異性膜抗原(PSMA)進行光學成像的探針,如CY7-3、CY7-2和L16(圖1a),它們在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的發射波長分別為767、767和800 nm,這些探針存在著近紅外一區(NIR-I)探針固有的缺點,例如穿透組織能力差,分辨率有限。近紅外二區 (NIR-II,1000-1700 nm)成像自體熒光水平較低,光子散射小,穿透能力強、具有高時空分辨率和高靈敏度的特點,可以顯著提高成像質量,可用于腫瘤切除術中導航。
作者在本文中設計、合成了一種帶有兩個前列腺特異性膜抗原(PSMA)結合基元的探針(PSMA-1092),該探針具有優異的光學性能(λmax= 1092 nm),對PSMA具有超高親和力(Ki= 80 pM)。采用PSMA-1092探針進行小鼠NIR-II成像,可以高分辨率顯現腫瘤(TNR= 7.62±1.05),邊緣清晰,然后,作者將PSMA-1092用于小鼠前列腺腫瘤切除術中導航,在腫瘤切除過程中,NIR-II成像可對肉眼檢查遺漏的殘余腫瘤進行實時成像檢測??偟膩碚f,PSMA-1092在描繪腫瘤邊緣和檢測殘余腫瘤方面表現良好,在臨床實踐中顯示了精確切除PCa腫瘤的潛力。
圖1:(a)以前報告的PSMA熒光探針的結構。藍色表示結合基序,紫色表示NIR-I區的熒光團。(b)新設計的NIR-II PSMA探針的結構。
考慮到供體-受體-供體(D−A−D)核心結構以及合適的電子受體和電子供體部分是獲得NIR-II近紅外二區熒光探針的關鍵因素,作者選擇苯二聯體(1,2,5-噻二唑)部分作為優良的電子受體。以兩個((S)5-氨基-1-羧基)氨基甲酰)- l -谷氨酸(Glu-urea-Lys)作為與PSMA特異性結合的基團,通過酰胺鍵與熒光團部分結合,增強了探針與PSMA的親和力(圖1b),此外,Glu-urea-Lys基團上的三個羧基也使探針具有較強的親水性,顯著提高了探針在水溶液中的溶解度,PSMA-1092探針的合成路線如下(方案1)。
方案1:試劑和條件:(a)丙烯酸、乙酸(20% in H2O),100℃,隔夜,94.5%; (b)叔丁醇、DCC、DMAP、CH2Cl2,室溫,隔夜,43.2%;(c)六丁基二錫烷, Pd(PPh3)4,甲苯,N2, 120℃, 2 h;(d) 4,7-二溴-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑,PdCl2(PPh3)2,甲苯,N2, 120℃,2 h, 7.7%;(e)鐵粉,醋酸,100℃,30分鐘,36.2%;(f) PhNSO, TMSCl,干吡啶,80°C,過夜,27.2%;(g) TFA, CH2Cl2,室溫,4 h;(h) 2,3,5,6-四氟苯酚,DCC, CH2Cl2,室溫,5 h, 67.4%;(i)二叔丁基(((S)-6-氨基-1-(叔丁基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酰)- l –谷氨酸,Et3N, CH2Cl2,室溫,6 h, 61.3%。
PSMA-1092探針由于D-A-D結構中強烈的分子內電荷轉移(ICT)效應,其熒光發射峰在1092 nm處測得(DMSO,圖2a,b),該峰位于近紅外二區,為了驗證PSMA-1092的光穩定性,將其二甲基亞砜溶液暴露于激光(727nm,10W)進行30分鐘的連續輻射,沒有觀察到明顯的光降解(圖2c),表明其出色的光穩定性。在PBS中測得PSMA-1092的量子產率為6.66%,這對于近紅外二區成像來說是足夠高的。利用近紅外成像系統,在不同的濾光片下進一步比較了PSMA-1092在PBS中的近紅外熒光信號。PSMA-1092溶液在1000和1200nm LP濾光片下可見,而在1300或1400納米濾光片下未檢測到信號(圖2d)??紤]到在1000nmLP濾光片下的熒光信號比其他濾光片更強,選擇1000nmLP濾光片用于進一步的體內近紅外二區成像??偟膩碚f,該探針具有良好的熒光發射波長、較大的Stokes位移和優異的光穩定性,在體內NIR-II近紅外二區成像方面具有很大的潛力。
圖2:(a) PSMA-1092的光學特性。在DMSO中吸收(λex1)和發射(λem1)波長。PBS中測量的量子產量。在酸性水溶液(pH = 2.66)中測定吸收光譜(λex2)和發射光譜(λem2)。Ki(受體親和力指數)通過LNCaP細胞(人前列腺癌細胞)裂解液的抑制實驗測定。Pka(結合常數)是根據Boltzmann曲線計算的。(b) PSMA-1092 (10 μM)在DMSO中的紫外-可見-近紅外吸收光譜和熒光發射光譜。(c) PSMA-1092 (10 μM)在727 nm連續激光照射DMSO中的光穩定性。(d) PSMA-1092 (0.43 mM)在PBS中與各種LP濾光片的NIR-II成像。白色虛線勾畫出了不可見的溶液。
此外,作者觀察到PSMA-1092的熒光性質在不同pH值的溶液中發生了顯著變化(圖3a,b),肉眼可以觀察到PSMA-1092溶液暴露在酸性溶液中,在自然光下由青色變為亮粉色(圖3c),在365 nm紫外光下(圖3d)或在NIR-I成像中(圖3e)可以觀察到熒光逐漸增加。熒光光譜顯示,熒光極大值從1092 nm藍移至620 nm,且隨著溶液酸度的增加,620nm處的熒光強度隨著溶液酸度的增加而大大提高(圖3a,b),當溶液pH從7變到0.3時,PSMA-1092溶液的熒光強度增加了85倍。此外,PSMA-1092在620 nm處的熒光強度圖與pH值的Boltzmann曲線擬合良好(R2= 0.9984),計算得到pKa為1.95(圖3b)。PSMA-1092的pH響應突出了其在更廣泛領域的應用潛力,比如在非侵入性測量胃液pH值時,從NIR-II區域到NIR-I區域的巨大波長位移可以有效地避免原始波長的影響,從而提高了檢測精度,進一步的pH響應應用作者仍在研究當中。
為了進一步測試PSMA-1092的體內性能,我們使用皮下LNCaP(人前列腺癌細胞)荷瘤小鼠(n = 3)進行NIR-II成像。尾靜脈注射PSMA-1092(劑量為2.5毫克/千克體重),在不同的時間點(1、2、4、6、8、12、24 h,圖4) (792nm激光激發,100 mW / cm2 功率密度 )(1000 nmLP濾光片,50 ms曝光時間)進行NIR-II成像。如圖4所示,PSMA -1092在注射后2小時內在腫瘤及周圍組織中積累(圖4c)。注射后4小時,腫瘤與周圍組織區別開來,具有良好的對比度(圖4d),并且在隨后的時間點保持了高質量圖像 (圖4e-h),這表明成像性能優異且在小鼠模型中具有高穩定性。為了獲得更詳細的藥代動力學信息,進行了基于近紅外圖像的腫瘤與正常組織比率(TNR)的半定量分析。由于PSMA-1092在正常組織中的清除速率快于在腫瘤中的清除速率,因此在注射后6小時達到腫瘤攝取量,而在注射后12小時獲得TNR峰值(7.62±1.05,圖4j)。根據勞斯判據,至少需要5的TNR才能區分圖像特征。在近紅外二區成像中,PSMA-1092的TNR值在注射后8小時達到5.99±0.72,并在隨后的時間點保持高水平(注射后12小時為7.62±1.05,注射后24小時為6.66±1.48,圖4j),TNR值始終高于勞斯判據,可實現高質量的近紅外二區成像。為了驗證PSMA-1092對PSMA的特異性,我們進一步對荷瘤小鼠進行了阻斷實驗(每組n=3)。聯合注射2-PMPA(一種強效和選擇性的谷氨酸羧肽酶II抑制劑,IC50=300 pM,34.3 mg/kg體重)和PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)后于選定時間點獲得NIR-II圖像(792 nm激光激發,1000 nm LP濾光片,50 ms曝光時間)。只注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)的荷瘤小鼠作為對照,如圖4k所示,在阻斷組中,活體小鼠的大部分腫瘤信號可被2-PMPA抑制,半定量分析表明,注射后6 h,對照組的TNR值遠高于阻斷組(圖4m),進一步的離體成像顯示,聯合注射2-PMPA和PSMA1092后,來自腫瘤和腎臟的熒光信號被成功降低(圖4l)。這些結果很好地證明了PSMA-1092是PSMA的特異性配體,具有超高的親和力,滿足了NIR-II探針的成像需求。
為了驗證PSMA-1092在腫瘤切除手術中進行精確熒光圖像導航的可行性,作者選擇活體LNCaP(人前列腺癌細胞)荷瘤小鼠在麻醉下進行腫瘤切除試驗。根據上述影像數據,選擇在尾靜脈注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重) 24 h后作為手術的時間窗,以獲得背景信號。在整個手術過程中,小鼠以0.4 L/ min的速度被異氟醚和氧氣聯合氣體麻醉,在NIR-II近紅外二區導航下切除腫瘤,整個過程由顯像儀記錄。首先,解剖腫瘤區域周圍皮膚,暴露腫瘤(圖5b,c)。半定量分析顯示,切除覆蓋皮膚后,TNR值增加(從7.95增加到9.81,圖5n)。然后切除腫瘤(圖5d,f,g),肉眼檢查認為腫瘤已*切除。但周邊仍可見強烈的熒光信號(圖5i), TNR值為5.48(圖5n),提示手術邊緣仍有遺漏的殘余腫瘤。在NIR-II熒光成像引導下,進一步切除殘余腫瘤(圖5j),同時盡可能保持健康組織,切除后TNR值降至3.12(圖5n)。但擴大切除后,剩余組織中仍能檢測到熒光信號(圖5j)。進一步檢查發現漏診的微小腫瘤(圖5k,l,紅色箭頭所示),再進一步切除腫瘤,影像學檢查未見殘留熒光信號(TNR = 2.97,圖5m,n)。蘇木精和伊紅(H&E)染色的組織學研究表明,切除的腫瘤是低分化癌??偟膩碚f,PSMA-1092探針具有出色的腫瘤描繪能力,在腫瘤切除術中導航方面具有臨床轉化潛力。
參考文獻
Zhang Longfei et al. Visualizing Tumors in Real Time: A Highly Sensitive PSMA Probe for NIR-II Imaging and Intraoperative Tumor Resection.[J]. Journal of medicinal chemistry, 2021
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