P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶產(chǎn)品簡(jiǎn)介

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶是基于 Pyrococcus furiosus 的高溫 DNA 聚合酶，具有耐熱型 5´-3´ 的聚合酶活力以及 3´-5´的核酸外切酶活力，因此屬于高保真 DNA 聚合酶（其保真度達(dá)到普通 Taq 酶的 55 倍）。該酶經(jīng)過(guò)生物工程改造后，其擴(kuò)增能力、保真度都得到提升，并且具有廣泛的模板適應(yīng)性，擴(kuò)增速度達(dá)到 2-4kb/min。優(yōu)化的 2×P6 buffer反應(yīng)緩沖液對(duì)于簡(jiǎn)單或復(fù)雜模板、短片段或長(zhǎng)片段 PCR擴(kuò)增都具有良好的適應(yīng)性，其中，質(zhì)粒、λ DNA 等簡(jiǎn)單模板有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 40 kb，cDNA 有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 15 kb，基因組有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 20 kb。

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶產(chǎn)品組成

組分 

P6 High-Fidelity DNA Polymerase 

2× P6 buffer 

dNTPs (10 mM each) 

Loading buffer 

產(chǎn)品應(yīng)置于-20 ℃保存。

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶產(chǎn)品質(zhì)控

（1）性能檢測(cè) 1：

在 50 μL PCR 反應(yīng)體系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 質(zhì)粒，擴(kuò)增 15 kb 的 DNA 目的片段，在 30 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)可在 15 kb 處檢測(cè)到非常亮且單一的目的條帶。

（2）性能檢測(cè) 2：

在 50 μL PCR 反應(yīng)體系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、大腸桿菌菌落，擴(kuò)增 5 kb 的 DNA 目的片段，在 30 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)可在 5 kb 處檢測(cè)到較亮的單一目的條帶。

（3）大腸桿菌核酸殘留檢測(cè)：

在 20 μL 熒光定量 PCR 反應(yīng)體系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase 和大腸桿菌特異基因擴(kuò)增引物（如 gapA）；在不加入大腸桿菌 DNA 模板的情況下，20 個(gè)循環(huán)內(nèi)熒光信號(hào)值在基線范圍。

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶常規(guī) PCR 反應(yīng)體系： 6 High-Fidelity DNolymerase

2. PCR 反應(yīng)參數(shù)（供參考）：

(起始變性): 95 ℃ 5 min

(解鏈): 95 ℃ 30 sec

(退火): 55 ℃ 30 sec

(延伸): 72 ℃ x min （30-35 循環(huán)：2 kb/min）

(終延伸): 72 ℃ 7 min

1. 在冰浴上設(shè)置 PCR 反應(yīng)（供參考）：

模板: < 500 ng

2× P6 Buffer: 25 μL

Primer 1/2: 0.2 - 1.0 μM

dNTPs (10 mM): 1 μL

P6: 1 μL

滅菌蒸餾水 Up to 50 μL

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶應(yīng)用實(shí)例

P6 擴(kuò)增速度測(cè)試

以pUC18質(zhì)粒為模板擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的DNA的片段，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

常規(guī) PCR 擴(kuò)增指南：

1. 簡(jiǎn)單模板如質(zhì)粒等可按照 5 sec/kb 設(shè)置程序。

2. 大多數(shù)模板的預(yù)變性溫度為 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板預(yù)變性溫度為 98 度，30 sec-5 min。

3. 常規(guī)退火時(shí)間設(shè)置為 10 sec，復(fù)雜模板設(shè)置為 10 sec-30 sec。

P6 擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的 DNA 的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的 DNA 的片段，PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

長(zhǎng)片段擴(kuò)增指南：

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 增加引物長(zhǎng)度提高退火溫度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加適當(dāng)濃度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 增加體系中 P6 使用量。

5. 提高變性溫度為 98 度，縮短變性時(shí)間為 5 sec。

P6 擴(kuò)增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA 的片段。

以人基因組為模板擴(kuò)增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序設(shè)置為：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

高 GC 和低 GC 模板擴(kuò)增指南

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 高 GC 模板可適當(dāng)添加 DMSO，一般終濃度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可適當(dāng)提高退火溫度，還可使用 Touch down 的方法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

4. 低 GC 含量模板可以適當(dāng)降低退火溫度。