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(一)高層瓊脂柱法

此法很簡單，只需把含有1%葡萄糖的瓊脂培養基裝至試管的三分之二高度，冷卻凝固后，用接種針穿刺接種至瓊脂底部，培養后厭氧菌在底部生長，越接近表面越差。也可在滅菌后冷卻至45 ℃左右的瓊脂中，直接用無菌吸管加入適量的菌懸液，然后迅速用兩手搓轉式管使之混勻，再放入冷水中使之凝固。培養后厭氧菌會在管的深處出現。

(二)黃磷法

在能密封的玻璃容器的底部放少量的水和一塊擱板，培養皿或試管接種完后用紙包好放于擱板上。在容器的上部放一個無菌培養皿，把碳酸鈣和黃磷放于皿中，用燒紅的接種針引燃黃磷后，立即封閉容器。黃磷燃燒消耗掉容器中的氧，形成無氧環境。生成的氧化磷可被水吸收， 1L的容積需用1 g黃磷。

(三)厭氧罐法

1.厭氧罐體的結構

目前使用的厭氧罐的罐體采用透明聚碳酸酯硬質塑料或不銹鋼制成。圓形罐蓋的周邊凹槽內嵌有橡皮圈，能使罐體和蓋密封。罐體與罐蓋之間有一個大的金屬螺旋夾，可使罐體密閉。罐體內蓋的正中下方，有個金屬絲網盒或金屬盤，用于放催化劑。

2.厭氧罐的原理

原理是用物理或化學的方法把密閉容器中的氧除去，制造一個無氧環境。常用的方法是油氣換氣法和氣體發生袋法。

抽氣換氣法：先把需厭氧培養的平板或液體瓶放入真空厭氧缸或厭氧罐中，再放入鈀粒催化劑(可使罐中的氧與氫反應生成水，除去氧)和美藍指示劑(缸中有氧時，指示劑為藍色，缸中無氧時，指示劑變無色),然后利用真空泵對真空厭氧缸或厭氧罐抽真空，再反復充入無氧的氮氣3次，后充入80%的氮氣、10%的氫氣和10%二氧化碳的混合氣體。鈀粒能夠促使混合氣體中氧反應掉，美藍指示劑顯示無色，則厭氧環境形成。鈀粒催化劑用過后，經干熱2h后可重復使用。打開觀察培養物后需重新抽氣換氣。

 該法的特點是只利用化學方法造成無氧環境，簡便易行。該方法是在厭氧罐中放一個氫氣、二氧化碳氣體發生袋、催化劑、美藍指示劑。在鈀粒催化劑的作用下，罐中的氧氣和氫氣反應生成水，從而造成罐內的無氧環境。氣體發生袋是由一丸氯化鈷合劑、一丸碳酸氫鈉檸檬酸合劑及一片濾紙條組成。使用時剪去部分的一角，加入10 mL水，水沿濾紙滲到兩個試劑丸上，發生反應，產生氫氣和二氧化碳。

使用時，加水后應立即放入罐中并密閉，即可厭氧培養。

(四)厭氧袋法

厭氧袋是一種無毒、透明不透氣的復合塑料薄膜袋。袋中裝有產生氫氣和二氧化碳的安剖瓶1只，已還原成無色的美藍指示劑安剖瓶1只和鈀催化劑。使用時，把需培養的平皿放入厭氧袋中，用彈簧夾夾緊袋口，呈密閉狀態，先折斷氣體發生安瓿瓶，反應結束后(0.5 h左右),再折斷美藍指示劑安瓿瓶，若指示劑不顯色，則可進行培養。

現在，出現了一種更為方便的厭氧藥劑袋，只需把藥劑(產氣袋)外包裝剪開放入袋(盒或罐)內(見下圖),密封后即可形成適宜的厭氧環境。藥劑袋分厭氧培養、微需氧培養和嗜二氧化碳培養三種類型。*厭氧可同時放置指示劑。此法操作更加簡便，不用加水、不用催化劑。厭氧產氣袋反應30 min后氧氣濃度降為0;微需氧產氣袋反應后達到氧氣濃度8%-9% ,二氧化碳濃度7%~8%;二氧化碳產氣袋反應后達到氧氣濃度15%左右，二氧化碳濃度6%左右。

(五)培養箱法

對高度厭氧菌的培養，用上面的介紹方法難以達到要求，需使用專門的厭氧培養箱。厭氧培養箱內充滿氮氣、氫氣、二氧化碳的混合氣體，通過箱上帶的橡膠手套，可以使所有的操作都能在箱內進行。

(六)氧化酶法和氧化酶平板法

氧化酶法是在氧化酶平皿中，先將0. 1 ml.的氧化酶加入到5mL的肉汁培養基中，再倒入厭氧培養基混合，當培養基處于融化狀態時即加入厭氧菌。因皿蓋內有一個內環，它與平板表面形成一個牢固的密封環境，氧化酶可還原培養基中瓊脂表面和蓋子之間的空間氧。

氧化酶平板法是先在氧化酶平皿中放入傳統的厭氧培養基和少量的氧化酶制劑制成平板，使用時，直接進行劃線接種，在有氧的條件下培養即可。

(七)焦性沒食子酸法

1. Wright管法

Wright管法(見圖4-2)可用于嚴格的厭氧菌培養。原理是焦性沒食子酸與氫氧化鈉溶液反應，吸收斜面與棉塞間的氧氣。方法是在Wright管的斜面上劃線接種厭氧菌后，將培養管口的棉塞修剪后用玻璃棒推入管內，使它剛好在斜面的上方，再在棉塞的上方和管口空間內填焦性沒食子酸結晶，再加入1 ml 10%氫氧化鈉溶液，后在管口塞上橡皮塞，立即倒置，放于培養箱中培養。

2. Buchner管法

Buchner管是一個厚壁的玻璃管，它的下端變細，使裝入的試管不能到達底部，管口有橡皮塞可使管密封 培養時先在管的底部加入少許的焦性沒食子酸，然后加入氫氧化鈉溶液和接種好的試管，立即用橡皮塞封住管口，再放入培養箱培養即可。焦性沒食子酸和氫氧化鈉的用量是100 mL的容積用1 g焦性沒食子酸和5 mL 20%氫氧化鈉溶液。

3.干燥器法

真空干燥器的構造如圖4-3,在隔板下放一個培養皿底蓋，蓋中加入5 ml. 10%氫氧化鈉(或2. 5 ml. 20%氫氧化鈉或50%過飽和氫氧化鈉),在蓋上方放置一塊載玻片，玻片上放0.5 mg焦性沒食子酸。把需要培養的試管(或培養皿)和一瓶美藍試劑放在隔板上，然后蓋上干燥器的蓋子(邊緣涂抹少量的凡士林)上，密封好。稍微傾斜干燥器，使焦性沒食子酸與氫氧化鈉混合，吸收氧氣，同時打開與干燥器連接的真空泵，抽出干燥器中的空氣，即可放培養箱中培養。

(八)除氧法Hungate厭氧技術

Hungate厭氧技術是美國微生物學家R. E. Hungate于1950年發明的一套用于厭氧菌分離和培養的嚴格的厭氧技術，它包括培養基預還原和在無氧環境中進行的菌株分離和培養操作技術。除氧法Hungate厭氧技術的原理是利用除氧銅柱制備高純氮，來驅除小環境中的空氣，使整個操作過程從培養基的配制、分裝、滅菌，以及菌懸液的稀釋、接種、培養、分離、移種至保蔽笙卻外干高度無氧的條件進行，從而保證嚴格厭氧菌的存活和生長。

1.銅柱除氧系統的原理

銅柱是由內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管構成，長約40 mm ~400 mm,兩段被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱層，通過與變壓器相連來控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端用膠管一端連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。當從氣鋼瓶出來的氣體如氮氣、二氧化碳和氫氣等含有微量氧氣時，這些氣體通過溫度約360 ℃的銅柱時，銅和氣體中的微量氧氣化合生成氧化銅，而氧化銅又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復使用，并不斷起到除氧的目的。

2.預還原培養基及稀釋液的制備

先將配制好的培養基和稀釋液煮沸驅除氧氣，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5 mlL ~5 mL,稀釋液裝9 ml,同時插入通氮氣的長針頭以排除氧氣，直至培養基內加入的氧化還原指示劑-刃天青由藍到紅后變成無色，證明試管內氧氣已被*去除，再蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌。

3.樣品不同稀釋度的制備

在無菌條件下準確稱取1g固體或用無菌注射器吸取1 mL混合均勻的液體樣品，而后加入按此操作方法依次進行10倍系列稀釋，制成不同濃度的樣品稀釋液。選適宜的三個稀釋度進行試管培養計數。

4.厭氧滾管培養法

將盛有無氧無菌瓊脂培養基的試管加熱至100 ℃，使瓊脂熔化，并保溫在50 ℃左右的水浴中，備用。用無菌注射器取至少3個稀釋度的樣品稀釋液0.1 mL,加入盛有融化的預培養基在試管內壁立即凝固成一薄層。適溫培養后，在瓊脂層內或表面形成肉眼看見的菌落。移種挑取單菌落時，將帶有單菌落的試管和需接種的盛有無菌、厭氧培養液的試管固定在適當的支架上，去掉試管的膠塞，同時插入用火焰滅過菌的注射器氮氣長針頭，通入氣流速度適當的、無菌的高純氮氣。將挑菌落的無菌彎頭毛細管的粗口端接一約60 cm長的乳膠

管，小心插入形成單菌落的試管內，用嘴咬住膠管的另一端，輕輕吸取待取的單菌落，轉移至盛有厭氧培養液的試管內，塞上膠塞，擰緊螺口膠木蓋，適溫培養。

5.活菌（分離）計數

選擇分散均勻，數量在幾十至幾百個菌落的厭氧試管進行活菌計數，即可得出每克或每毫升樣品中含有的厭氧菌的數量。

6.計算

活菌數量CFU/g( mL)樣品=0. 1 ml滾管計數的實際平均值x 10 x稀釋倍數。