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【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

體外檢測(cè)小鼠血清中TNF-α的濃度，了解小鼠攻毒后對(duì)TNF-α的變化的影響

【實(shí)驗(yàn)原理】

將酶與試劑抗原用交聯(lián)劑結(jié)合起來，此種酶標(biāo)記抗原與抗本中相應(yīng)抗體發(fā)生特異反映，并牢固結(jié)合，在加入相應(yīng)的酶的底物時(shí)，底物被酶催化生成呈色產(chǎn)物，可根據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗夾心Elisa法檢測(cè)樣本中小鼠TNF-α的濃度

【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】

試劑：TNF-α定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

器材：4℃和-20℃冰箱、水浴鍋、恒溫箱、酶標(biāo)儀、電腦、排槍、移液槍、加樣槽、渦旋振蕩器、槍頭、96孔板

【實(shí)驗(yàn)步驟】

用去離子水將洗滌液稀釋到1倍（用到移液器）；將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100ul/孔）加入相應(yīng)空中（96孔板、移液器），對(duì)于血清先加入50ul樣本分析緩沖液后加50ul血清，若稀釋量大，就將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100ul，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120min（漩渦振蕩器、恒溫箱）；`用1倍洗滌液洗板5次，且后一次至厚吸水紙上拍干；加入生物素化抗體工作液（100ul/孔）。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育60min；洗板5次，且后一次至厚吸水紙上拍干（多孔道手動(dòng)移液器）；加入酶結(jié)合物工作液（100ul/孔）。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫孵育20min；洗板5次，且后一次置厚吸水紙上拍干；加入顯色劑TMB100ul孔，避光室溫孵育20min，加入終止液50ul/孔，混勻后即可測(cè)量OD450值（電腦、酶標(biāo)儀）

【注意事項(xiàng)】

1、ELISA實(shí)驗(yàn)是一個(gè)很*確的實(shí)驗(yàn)過程，所以要*確稀釋和加樣

2、恒溫箱中反應(yīng)時(shí)，要嚴(yán)格按照上面的時(shí)間，不易過長(zhǎng)

3、也可用洗板機(jī)洗板5次

4、反映終止后要快速測(cè)OD值，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性