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土壤微生物（細菌、霉菌）的分離及鑒定
一、 實驗目的
1) 了解并掌握光學顯微鏡的操作方法和觀察技巧
2) 學會細菌及真菌觀察鑒定的一系列實驗方法及其原理
二、實驗器材
1.試劑及藥品：
結晶紫染液、 95%乙醇、番紅染液、 5%孔雀綠水溶液、甘油、 1 mol/L NaOH 溶液 、 1 mol/L
HCl 溶液、盧戈式碘液、溴甲酚紫指示劑、甲基紅指示劑、吲哚試劑、NaCl、1.6%花生油中
性紅水溶液、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、滅菌水等。
2.器材：
三角瓶、試管、燒杯、培養皿、接種環、接種針、載玻片、蓋玻片、酒精燈、涂布棒、顯微鏡、電子天平、藥匙、玻璃棒、稱量紙、量筒、加熱爐、PH 試紙、高壓蒸汽滅菌鍋、棉花、紗布、牛皮紙、麻繩、恒溫箱、試管架、剪刀、鑷子、解剖刀、U 形管、移液管等。
3.樣品：
校園內草地深層土壤（深度 20cm）
三、實驗原理
1.細菌簡單染色
利用單一染料對菌體進行染色的方法叫做簡單染色。
2.細菌的革蘭氏染色
經此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色（紅色）的細菌為革蘭氏陰性菌。
3.細菌芽孢染色
首先用著色能力較強的染料，如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出。再用對比度大的復染劑（如番紅液）染色后，菌體染上復染劑顏色，而芽孢仍為原來的顏色，這樣就可以將兩者區別開來。
4.細菌的生理生化實驗
糖發酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應
甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
5.真菌的觀察及鑒定
將培養物直接置于顯微鏡下可觀察到霉菌自然生長狀態并可連續觀察不同時期發育期的菌體結構特征的變化。
四、實驗步驟
4.1 土壤菌群分離
4.1.1 滅菌準備
配制牛肉膏蛋白胨培養基和 PDA 培養基，分別裝入三角瓶中，封好。將內裝 90ml 的蒸餾水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培養基、涂布棒、移液管六支、試管（內裝 9ml 蒸餾水）六支、平皿若干放入滅菌鍋中滅菌。
4.1.2 梯度稀釋
稱取土壤樣品 10g 加入 90ml 滅菌水中振蕩，直至土壤大顆粒被*打碎，然后靜置 30 分鐘以上，使其澄清。實驗時要保持無菌操作，防止雜菌污染土壤菌液。梯度稀釋是將原液按照十倍的等級進行稀釋，在無菌的條件下，用移液管一取 1ml 上清液加入裝有 9ml 滅菌水試管中振蕩，將其稀釋為 10-1倍，用不同的移液管依次從已稀釋的菌液中取液，將菌液梯度稀釋為原液的 10-1、10-2、10-3、10-410-5
倍，分別為-1、-2、-3、-4、-5 梯度，分別表示稀釋原液用 0表示。
4.1.3 涂布平板
將冷卻至 50-55℃的牛肉膏蛋白胨培養基和 PDA 培養基倒平板，平板固定后進行涂布。在無菌條件下，用對應編號的移液管取菌液加到平板中，然后用涂布棒將其在平板鋪勻。細菌培養基對 0、 -2、 -4、 -5 梯度進行涂布，霉菌培養基對 0、 -3 梯度進行涂布。每梯度涂 3 個平板。
4.1.4 恒溫培養
將霉菌培養基放入 27℃恒溫箱中培養 3 天，將細菌培養基平板置于 37℃恒溫培養 24 小時。
4.1.5 菌落統計
對不同梯度的平板進行觀察，選擇合適梯度進行菌落計數，一般每平板 30 個為宜。此次試驗中，細菌培養基上-4 梯度為*佳。霉菌培養基中-3 梯度為*佳。在細菌培養基中，根據菌落形態的不同選取 5 種菌，考慮到可能有的菌相同，本組選取了6 種菌，對其進行觀察，描述菌落形態。選擇三種霉菌，對其編號。
4.1.6 畫線分離
配制牛肉膏蛋白胨培養基和 PDA 培養基，滅菌（滅菌鍋：山東興華）后倒取平板，將選出的菌進行劃線分離，考慮到菌數多，平板不足，每種菌只劃兩個平板。劃好后分別放入相應恒溫箱中培養。
4.2 細菌的純化及鑒定
4.2.1 細菌純化及保藏
配制培養基，在不同菌劃線的培養基中挑取單個菌落進行再次劃線，直至菌種*純化。
制備試管斜面，將菌劃斜面培養留種。
4.2.2 細菌形態觀察
對各菌進行制片，進行單染色觀察其形態
4.2.3 革蘭氏染色
為鑒定細菌的革蘭氏反應對菌進行革蘭氏染色，染色前先將進行標準株培養，標準株為大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌），將標準株與純化的八株菌進行培養 12-18 小時，這樣無芽孢的產生，可以防止其影響染色結果。染色完成后進行鏡檢。
4.2.4 穿刺實驗
穿刺實驗是對菌是否有鞭毛進行鑒定的十分有效的方法。
配制細菌穿刺培養基，該培養基與細菌培養基大體相同，將其中的瓊脂減少的原來的一半
即為半固體穿刺培養基。
（1）將培養基配好后加熱(微波爐)，使其*融化，略微冷卻后倒入試管中，密封后滅菌。
（2）冷卻固定后，在無菌（超凈工作臺：內循環風，蘇凈安泰）操作下，用接種針將各菌穿刺接種到半固體培養基中，穿刺時
盡量要直，避免劃壞培養基。
（3）將接種好的穿刺培養基放入 37℃的恒溫箱中培養 24 小時。
4.2.5 細菌芽孢染色
1) 制片
按常規涂片、干燥、固定。
2) 染色
加數滴 5%孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火（普通酒精燈）上加熱至染料冒蒸汽并開始計時。維持 5min。加熱過程中及時補充染液。切勿讓涂片干涸。
3) 水洗
待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗載玻片背面，直至流出的水無色為止。
4) 復染
用 0.5%番紅染液復染 1.5min 。
5) 水洗
用緩流水洗后，干燥。
6) 鏡檢（普通光學顯微鏡）
先低倍鏡，再高倍鏡，后油鏡觀察。
4.2.6 生理生化試驗
（1）配制培養基
分別配制淀粉培養基、油脂培養基，配制好后放入三角瓶中準備滅菌。配制葡萄糖和乳糖發酵培養基，裝入試管，將其中的德漢氏小管灌滿放入試管。配制蛋白胨水培養基和葡萄糖蛋白胨水培養基，配制好后加入試管中，每支試管 1/3 體積培養基，準備滅菌。
（2）接種準備
將培養基貼上標簽包好后放到高壓蒸汽滅菌鍋中，在 121℃滅菌 20 分鐘。滅完菌取出后冷卻，將淀粉培養基、油脂培養基倒平板。
（3）接種
①在淀粉培養基、油脂培養基平板背面用標簽筆畫一個十字，將其分為相等的四個區域，再在相應的位置寫上要種的菌種的編號，在無菌條件下，將菌種分別接在相應的區域，對于淀粉培養基，在接種時，采取觸點接種，對于脂肪培養基，采取畫十字接種,貼上標簽。
②在無菌條件下，將各菌種分別接在糖發酵培養基液中，每種菌在葡萄糖和乳糖培養基中各接兩支培養基，每種留一支作為對照，貼上標簽。
③在無菌條件下，將各菌分別接種在蛋白胨水培養基和葡萄糖蛋白胨水培養基中，每種菌分別在蛋白胨水培養基和葡萄糖蛋白胨水培養基中接兩支培養基試管，貼上標簽。
（4）培養
將接種好的培養基放到 37 攝氏度的恒溫箱中培養 48 小時。
（5）實驗觀察
4.2.7 確定菌屬
在根據以上實驗結果的基礎上，查詢伯杰氏手冊，確定菌的屬。
4.3 霉菌的純化及鑒定
4.3.1 霉菌純化
配制 PDA 培養基，將霉菌再次劃線，直至菌種*純化。
4.3.2 霉菌形態觀察
（1）營養小室及其他滅菌準備
（2）制備營養小室
（3）接種
（4）放置 27℃恒溫箱中培養三天
（5）培養三天后，將營養小室從恒溫箱中取出，用顯微鏡觀察霉菌形態。
4.3.4 霉菌鑒定
根據觀察結果，查詢相應的霉菌圖譜，確定分離出的霉菌的類別。