一、染色步驟

1. ?樣本固定?

• 成骨誘導分化結束后，吸去培養基，用1×PBS輕柔洗滌細胞2~3次?23。

• 加入4%多聚甲醛或10%福爾馬林固定液，室溫固定30分鐘?12。

2. ?洗滌與風干?

• 去除固定液后，用蒸餾水或1×PBS沖洗3次以去除殘留固定劑?12。

• 風干載玻片或培養板，確保樣本干燥?34。

3. ?染色處理?

• 加入0.1%茜素紅染色液（溶于0.05M Tris-HCL緩沖液，pH8.3），37℃孵育5-30分鐘（時間依鈣鹽含量調整）?12。

• 染色后迅速用蒸餾水沖洗，避免染料殘留導致背景過深?23。

4. ?復染與觀察?

• 可選固綠染色液復染1分鐘以增強背景對比度?34。

• 顯微鏡下觀察：鈣結節呈橙紅色，背景為綠色或粉紅色?23。

5. ?保存?

• 染色后樣本用封口膜密封，4℃保存可維持染色效果2周?23。

二、關鍵注意事項

1. ?操作輕柔?

• 避免劇烈震蕩或長時間暴露于液體中，防止鈣結節脫落?12。

2. ?染色條件優化?

• 染色液使用前需恢復至室溫，染色時間根據鏡下鈣鹽沉積量動態調整（通常5-10分鐘）?23。

• 染色過深時可用1%鹽酸酒精分色?4。

3. ?試劑選擇?

• 推薦使用商品化茜素紅S試劑（如Beyotime ST1078-5g），純度穩定?5。

• 固定劑優先選擇中性福爾馬林，避免酸性條件干擾鈣鹽結構?24。