分子實(shí)驗(yàn)-PCR

分子實(shí)驗(yàn)-PCR實(shí)驗(yàn)的原理是DNA分子在電場(chǎng)中會(huì)向正極方向移動(dòng)。不同長(zhǎng)度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。

　　1.試劑

　　PCR產(chǎn)物，TAE電泳緩沖液，1000x溴化乙錠儲(chǔ)存液，電泳級(jí)瓊脂糖，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

　　2.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

　　配制TAE電泳緩沖液(50x儲(chǔ)存液，pH約8.5: Tris 堿242g 57.1ml冰已酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water定容至lL)，6x加樣緩沖液(0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液) ; 1.5ml 離心管裝入鋁制飯|盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)。

　　3.操作步驟

　　(1)稱取0.4g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE電泳緩沖液(1x)，放入微波爐中燒開( lmin)。注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待*熔化后停止微波爐(切不可讓膠溶液溢出到微波爐中! )。

　　(2)戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手(約50-60°C)。

　　(3)把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20分鐘待膠*凝固。(剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用)。

　　(4)在水平電泳槽中加滿1xTAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長(zhǎng)度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm)，注意正負(fù)電極的位置連接正確。

　　(5)待膠*凝固后( 15-20分鐘)，小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺(tái)上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極。

　　(6)在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10μl 的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中(如果需要時(shí)，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3ul DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物)。

　　加樣時(shí)持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動(dòng)。看到藍(lán)色的樣品吸管尖頭伸進(jìn)加樣孔后(不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部)緩緩將藍(lán)色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍(lán)色樣品流到孔外。

　　(7)打開電源開關(guān)，樣品將形成條藍(lán)色的橫帶向前移動(dòng) (如果發(fā)現(xiàn)藍(lán)色向后移動(dòng)，立即關(guān)閉電源，調(diào)換電極)。電泳將進(jìn)行約30min。

　　(8)當(dāng)藍(lán)色的溴酚藍(lán)遷移到距凝膠邊緣1cm時(shí)，關(guān)閉電源。取出模具和凝膠。放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

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