文章圍繞KRAS突變的胰腺癌展開研究，揭示了腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞相互作用促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制，主要發(fā)現(xiàn)如下：

ERK活性與DUSP2的關(guān)鍵作用：KRAS突變雖啟動(dòng)PanIN形成，但因存在衰老和凋亡信號難以高效發(fā)展為PDAC。單細(xì)胞RNA測序表明，腫瘤進(jìn)展中ERK^activeDUSP2^low細(xì)胞亞群擴(kuò)張，DUSP2表達(dá)改變可調(diào)節(jié)ERK活性，DUSP2抑制在KRAS突變背景下為癌細(xì)胞提供生存優(yōu)勢。

巨噬細(xì)胞的調(diào)控影響：巨噬細(xì)胞數(shù)量隨胰腺癌進(jìn)展顯著增加，其可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞ERK磷酸化和DUSP2 表達(dá)降低，促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)遷移能力和anoikis抗性，使癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力。巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞相互作用還會(huì)促進(jìn)淋巴血管生成和免疫逃逸。

關(guān)鍵信號軸及臨床意義：TIMP -1 - CD63信號軸維持ERK^activeDUSP2^low細(xì)胞狀態(tài)，巨噬細(xì)胞是TIMP - 1主要來源，臨床數(shù)據(jù)顯示TIMP - 1和CD63高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)，該信號軸具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值，與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移及化療反應(yīng)等密切相關(guān)。

研究背景：

胰腺癌是一種惡性程度高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，預(yù)后較差。在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，致癌性KRAS突變扮演著關(guān)鍵角色，約90%的胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）存在該突變，且在約30%的胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN）中也能檢測到。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型里，Kras 激活雖能啟動(dòng)PanIN的形成，但要發(fā)展成PDAC還需較長時(shí)間，且進(jìn)一步進(jìn)展需要抑癌基因如Ink4a/Arf、P53等的失活。同時(shí)，PDAC具有特的生物學(xué)特性，其細(xì)胞增殖并不突出，但早期就容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間相互作用對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及藥物反應(yīng)有著重要影響，其中巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)機(jī)制卻尚未明確。基于上述背景，研究深入探究了KRAS突變的上皮細(xì)胞如何獲得逃避衰老和免疫清除的能力，進(jìn)而發(fā)展為晚期PDAC。

研究方法：

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞系、單核細(xì)胞系等，制備條件培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)、遷移實(shí)驗(yàn)、活力檢測等，通過RT-qPCR和Western blot分析基因和蛋白表達(dá)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立基因工程小鼠模型，進(jìn)行胰腺原位和門靜脈注射實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤進(jìn)展，對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色。

臨床樣本分析：獲取胰腺癌患者腫瘤標(biāo)本，進(jìn)行單細(xì)胞或批量RNA測序、數(shù)字空間分析，驗(yàn)證臨床相關(guān)性。

主要研究結(jié)果：

1. 持續(xù)的ERK活化可能是KRAS突變PDAC進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)力

通過對正常和Kras突變胰腺（KrasLSL?G12D/+, Pdx11Cre/+ ，KC）的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn) PanIN區(qū)域存在大量衰老和凋亡信號，這解釋了Kras 突變無法高效驅(qū)動(dòng)PanIN發(fā)展為 PDAC的原因。此外，對正常、早期和晚期胰腺腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，結(jié)果顯示隨著腫瘤進(jìn)展，細(xì)胞群體發(fā)生顯著變化，如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞比例增加，而T和 B細(xì)胞比例減少。上皮細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為八個(gè)亞群，其中E1和E2亞群的比例在腫瘤進(jìn)展過程中逐漸增加，表明這兩個(gè)亞群的細(xì)胞在腫瘤發(fā)展中起著重要作用。另外，分析表明E2亞群在更晚期的腫瘤階段富集，且表達(dá)Krt18和Krt19，而E1亞群仍保留較高水平的腺泡基因表達(dá)（Amy1/Amy2a2）。基因本體富集分析顯示，E1亞群主要參與細(xì)胞對炎癥、離子和應(yīng)激的反應(yīng)，提示該群體受到外部刺激；E2亞群則富集在上皮增殖、ERK信號傳導(dǎo)、遷移和細(xì)胞骨架組織等途徑，表明其在腫瘤進(jìn)展中與細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)。

圖1 Kras突變上皮細(xì)胞的E2子集隨著腫瘤的進(jìn)展而擴(kuò)大。

隨后分析了KRAS突變的胰腺癌中，ERK活性與DUSP2表達(dá)之間的關(guān)系，以及它們在腫瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制。對早期和晚期胰腺癌進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序結(jié)果顯示，隨著腫瘤進(jìn)展，成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞比例上升，T和B細(xì)胞比例下降。在上皮細(xì)胞的三個(gè)亞群（C1-Epi、C14-Epi和C15-Epi）中，C15-Epi在早期和晚期都表現(xiàn)出MYC和E2F靶通路的顯著富集。此外，DUSP家族成員在免疫細(xì)胞中表達(dá)水平較高，且DUSP1、DUSP2、DUSP4 和DUSP6在不同細(xì)胞類型中表達(dá)各異。進(jìn)一步分析上皮亞群中DUSP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有 DUSP2在晚期C15-Epi中的表達(dá)降低，這表明DUSP2表達(dá)下調(diào)可能與ERK活性上調(diào)有關(guān)；隨后在PANC-1胰腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DUSP2及磷酸酶失活的DUSP2，以及敲低DUSP2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染DUSP2可降低ERK活性，而敲低DUSP2則增加ERK磷酸化。在基因工程小鼠模型中，Kras 突變背景下敲除DUSP2，會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的胰腺病變，且凋亡細(xì)胞減少。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)DUSP2表達(dá)改變足以調(diào)節(jié)ERK活性，DUSP2抑制在Kras突變背景下為癌細(xì)胞提供生存優(yōu)勢。

圖2 胰腺癌中細(xì)胞群體特征、相關(guān)基因表達(dá)差異及DUSP2對ERK活性的調(diào)控研究。

2. 巨噬細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞中ERK活性和DUSP2表達(dá)的調(diào)控作用及其與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系

通過scRNA測序發(fā)現(xiàn)胰腺癌微環(huán)境中巨噬細(xì)胞從早期到晚期顯著增多。用巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基MCM處理PANC-1細(xì)胞或讓單核細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)，可使ERK磷酸化增加、DUSP2表達(dá)降低，說明癌細(xì)胞與單核細(xì)胞相互作用能調(diào)節(jié)ERK/DUSP2軸。MCM處理后，ERK快速激活且至少持續(xù)2天，DUSP2降低在ERK激活后出現(xiàn)，ERK抑制劑可逆轉(zhuǎn)相關(guān)變化。在Kras突變小鼠模型中，ERK1/2磷酸化區(qū)域與腫瘤晚期及巨噬細(xì)胞相關(guān)，DUSP2敲除會(huì)增強(qiáng)pERK和周圍巨噬細(xì)胞數(shù)量，證實(shí)巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞ERK持續(xù)激活。

圖3巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞ERK持續(xù)激活

3. 胰腺癌癥細(xì)胞ERK^activeDUSP2^low軸抑制E-cadherin和促進(jìn)轉(zhuǎn)移能力

經(jīng)MCM處理的PANC-1細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，E-cadherin 表達(dá)顯著降低。抑制ERK磷酸化可逆轉(zhuǎn)E-cadherin的表達(dá)，表明MCM通過ERK激活抑制E-cadherin。DUSP2敲低細(xì)胞表現(xiàn)出與MCM處理相似的表型，且MCM處理的細(xì)胞anoikis 抗性（失巢凋亡抗性，細(xì)胞抵抗因脫離細(xì)胞外基質(zhì)而引發(fā)程序性死亡的能力）增加。此外，將KPPC細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)，MCM處理的KPPC細(xì)胞能形成更具侵襲性的腫瘤并發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，說明MCM處理使胰腺癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力，而這與E-cadherin的變化密切相關(guān)。

圖4 MCM表觀遺傳學(xué)修飾抑制E-cadherin表達(dá)并促進(jìn)轉(zhuǎn)移。

4. ERK^activeDUSP2^low腫瘤細(xì)胞加劇巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤惡性表型

將MCM處理的腫瘤細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)，腫瘤更大且部分出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，同時(shí)E-cadherin受抑制，VEGF-C表達(dá)增加，促進(jìn)淋巴血管生成。細(xì)胞Chat分析顯示腫瘤細(xì)胞上調(diào)PD-L1信號以逃避免疫監(jiān)視，DUSP2-KD細(xì)胞中PD-L1表達(dá)增加，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)。用KPPC小鼠來源的癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ERK磷酸化和PD-L1表達(dá)，使其逃避T細(xì)胞殺傷，揭示巨噬細(xì)胞能幫助癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。

圖5 巨噬細(xì)胞促進(jìn)ERK^activeDUSP2^low腫瘤細(xì)胞的淋巴管生成和免疫逃逸。

5. ERK^activeDUSP2^low信號受TIMP-1-CD63軸持續(xù)活化

通過細(xì)胞因子陣列分析，確定TIMP-1可能是維持癌細(xì)胞ERK^activeDUSP2^low狀態(tài)的關(guān)鍵因子。敲低CD63后，MCM誘導(dǎo)的ERK磷酸化維持能力下降，表明TIMP-1-CD63信號介導(dǎo)了ERK的持續(xù)激活。臨床樣本分析顯示，免疫細(xì)胞中的TIMP-1與癌細(xì)胞中的CD63呈正相關(guān)，高表達(dá)的TIMP-1和CD63與患者預(yù)后不良相關(guān)，且該關(guān)聯(lián)在M2巨噬細(xì)胞存在時(shí)更顯著。

圖6 巨噬細(xì)胞與ERK^activeDUSP2^low上皮細(xì)胞之間的信號相互作用。

6. PDAC隊(duì)列中TIMP-1和CD63相互作用的臨床相關(guān)性

對人PDAC樣本進(jìn)行數(shù)字空間分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中TIMP-1的主要來源，且 TIMP-1在M2巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞中的TIMP-1與癌細(xì)胞中的 CD63呈正相關(guān)。對97例胰腺癌樣本的研究顯示，TIMP-1和CD63高表達(dá)與患者無病生存期差相關(guān)，具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移及化療反應(yīng)等相關(guān)。在不同隊(duì)列分析中，TIMP-1/CD63軸與M2巨噬細(xì)胞signature結(jié)合時(shí)，對預(yù)后判斷意義更顯著，凸顯其在影響疾病結(jié)局中的重要性。

圖7 Mac-TIMP-1和Epi-CD63的表達(dá)預(yù)測PDAC不良預(yù)后。

創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處

研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1-CD63信號軸在調(diào)控KRAS突變的胰腺癌細(xì)胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，拓展了對胰腺癌發(fā)病機(jī)制的理解，為后續(xù)研究提供了新的靶點(diǎn)和方向。通過單細(xì)胞RNA測序等技術(shù)，鑒定出ERK^activeDUSP2^low細(xì)胞亞群在胰腺癌進(jìn)展中的重要作用，揭示了其與巨噬細(xì)胞相互作用的機(jī)制，為深入理解胰腺癌的發(fā)展過程提供了新的細(xì)胞層面的證據(jù)。

文章雖在KRAS突變胰腺癌研究上取得成果，但仍可能存在局限：

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头矫妫盒∈竽Ｐ团c人類胰腺癌存在差異，基因背景、腫瘤微環(huán)境及對治療反應(yīng)不同，限制了研究成果向臨床的轉(zhuǎn)化。

研究范圍：僅聚焦特定細(xì)胞亞群和信號通路，忽略了腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞和分子的影響，且未充分探討性別、年齡等因素對胰腺癌進(jìn)展的作用。此外，臨床樣本量偏小且存在隊(duì)列差異，影響研究結(jié)論的普適性和可靠性。

作用機(jī)制：雖揭示了關(guān)鍵信號軸，但對其上下游調(diào)控機(jī)制及相互作用細(xì)節(jié)了解不足，如TIMP -1如何精確調(diào)節(jié)DUSP2的表達(dá)，以及CD63下游的信號傳導(dǎo)通路具體細(xì)節(jié)還不清楚。此外，臨床樣本量小且存在隊(duì)列差異，影響研究結(jié)論的普適性和可靠性。

原文鏈接：https:  //  molecular-cancer.biomedcentral.  com/articles/10.1186/s12943-024-02207-4