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生物打印123，如何選擇生物墨水、細胞及生物打印？
閱讀：441 發布時間：2024-1-22生物墨水類型概述
生物墨水是用于3D生物打印的生物材料。生物墨水的材料特性會影響其與細胞的相互作用及其作為生物打印結構的成功。理解生物打印中使用的各種材料的一種方法是按它們在打印過程中的角色對它們進行分類。給定的生物墨水可以是基質墨水、支撐墨水或犧牲墨水。
基質墨水
基質生物墨水保持和支持細胞，在生物打印中起著重要作用。大多數基質生物墨水是水凝膠，這意味著它們主要由水組成。目前市場上的生物墨水具有優勢和劣勢，通常滿足生物打印所需的部分但不是全部要求。其他類別的試劑可以幫助彌補這些弱點。有關基質油墨的一些示例及其主要用途。
支撐墨水
支持生物墨水是生物相容性材料，比基質墨水具有更好的機械性能。通常使用支持油墨來支持生物打印結構，因為水凝膠往往柔軟且結構完整性低。支持生物墨水也常用于結締組織或硬組織應用，例如軟骨、骨骼或肌肉組織的制造。有關支撐油墨及其使用條件的一些示例，請參見下表。
犧牲墨水
顧名思義，犧牲生物墨水被設計為作為臨時支撐物沉積，然后在后處理中移除。它們通常用于創建復雜的負幾何形狀，例如血管網絡。在某些情況下，它們還可以用于提高使用本身形狀保真度較差的材料制成的打印件的分辨率。有關支撐油墨及其使用條件的一些示例，請參見下表。
支撐墨水
雖然支撐和犧牲生物墨水可以提供持續或臨時的加固，但這無助于僅由軟水凝膠或其他幾何復雜組成的結構。像FRESH這樣的方法涉及打印到支撐槽中，從而能夠創建這樣的結構。
近端小管 STL 文件（左）、FRESH 漿液中的生物打印小管（中）、FRESH 后處理的小管（右）
交聯固化劑
通過將細胞封裝在生物墨水中，細胞能夠在活組織中生長和重塑生物打印結構。使用天然生物墨水可以幫助他們做到這一點，因為它含有天然蛋白質。蛋白質對不同的組織類型是不同的，并增加了生物墨水的特異性，使它們能夠針對特定應用進行定制。玻連蛋白或纖連蛋白等蛋白質在體內用于調節細胞行為，如粘附、遷移、增殖和分化，并介導與膠原蛋白、肝素和GAG的相互作用。
光引發劑
光交聯是增加基質油墨硬度的幾種交聯選項之一，這在某些結構中是可取的。特別是光交聯利用電磁輻射中的能量來激活硬化過程。光引發劑是將必要的自由基引入基質生物墨水以允許光交聯的物質。它們主要在可以激活它們的電磁頻譜范圍內有所不同。
3D模型指南
在3D打印之前，你必須知道這個物體是什么樣子的。無論該對象是簡單的測試圓柱體還是復雜的血管網絡，您通常都從 3D 模型開始，將該模型轉換為 STL 文件，然后將該 STL 文件轉換為 G 代碼文件，您的打印機會將其解釋為電機運動。下面，我們將討論如何將您的打印對象從想法轉化為 STL。
自己設計
有許多程序可以讓您自己設計 3D 模型。這些通常被稱為CAD（計算機輔助設計）程序。SolidWorks、Inventor 和 AutoCAD 都是流行的選項，但您可以探索很多選項。設計自己的模型的主要優點是可以控制形狀。將模型雕刻成您喜歡的規格后，您可以將 CAD 文件另存為 STL 文件，然后就可以繼續切片了。
從醫學影像轉換
許多研究人員在開發 3D 模型時使用的另一種技術是將醫學成像樣本轉換為 STL 文件。CT 掃描是常見的轉換成像類型，但可以使用大多數形式，特別是如果它們可以保存為 DICOM（醫學數字成像和通信）文件。轉換由軟件執行，該軟件將成像樣品中記錄的光強度轉換為相應的組織類型，并確定組織之間的邊界。Mimics、3D Slicer 和 InVesalius 3 等程序都是流行的選擇。轉換醫學成像結果的主要優點是所生成模型的臨床相關性。
使用數據庫
如果您無法訪問臨床成像樣本，有許多數據庫可供選擇，其中包含 DICOM 衍生的 STL。許多學術機構都有自己的圖書館，并且存在提供許可協議的私人館藏。您可以在下面找到數據庫列表。
打印參數
3D生物打印中使用的每種材料都需要不同的設置，以獲得的擠出和干凈的線條。打印參數可以在微觀層面上影響結果，例如細胞活力，以及宏觀結果，例如孔徑和結構保真度。下面我們將討論使用Allevi生物打印機進行氣動擠出生物打印工藝的關鍵參數。
切片參數
切片，或將 STL 轉換為 G 代碼文件的過程，需要不同的設置，告訴軟件如何將 STL 劃分為多個層，以及打印機如何移動以創建結構。這些設置包括層高、噴嘴大小和打印速度。一般來說，層高與噴嘴尺寸密切相關，因為噴嘴往往具有圓形橫截面。需要注意的是，打印速度是指擠出機相對于打印表面的運動，而不是擠出材料的流速。材料屬性（如粘度）的變化會導致不同的材料在不同的設置下表現更好。例如，有些材料非常粘稠，擠出速度很慢，需要較慢的打印速度才能匹配。
需要注意的是，打印生物材料分辨率的限制因素是針頭的直徑。隨著層高的降低和打印速度的提高，分辨率通常也會提高。但是，噴嘴尺寸越大、層高越大、打印速度越慢，擠出就越容易。這些參數之間的平衡通常是打印優化的主題，下面將對此進行討論。選擇這些參數后，可以將 STL 切片為 G 代碼。
填充物是指印刷品特征表面或外殼內的材料。在其他 3D 打印應用中，填充通常由幾何形狀和占用體積百分比定義。Allevi 系統允許您在所選填充圖案中設置填充線之間的距離，從而更地控制終結構。您需要填充物的形狀和數量將因構建體的目的和您使用的細胞系而異。
打印機參數
準備好 G 代碼后，您仍然需要為您的材料輸入正確的打印機設置。在 氣動擠出平臺中，這些因素包括壓力、溫度和交聯。
隨著時間的流逝，我們已經優化了一些適用于一些常見生物材料的參數。這些通用打印參數非常適合剛開始使用新材料，并作為進一步優化的起點。
針
針頭特征（如規格、長度、輪廓和材料）會顯著影響您可以使用的壓力、溫度和速度。雖然針頭的通常很明顯，但請使用我們的針頭選擇指南來權衡所有因素。
交聯
交聯是軟網絡分子改變其相互作用的過程，導致材料變硬。這可以通過下面進一步討論的幾種機制來實現。采用可用于光交聯的 LED。用于熱交聯的加熱床板。化學交聯也可以借助打印機配件（如培養皿和同軸打印噴嘴）進行利用。
優化
應用各不相同，終結構的目標規格也各不相同。也許您追求速度和高吞吐量，或者您更專注于精細分辨率。無論哪種方式，優化打印參數都是關鍵步驟。
基材
常見類型的打印基材
構建表面有三種基本類型：載玻片、培養皿和孔板。載玻片可用于將構建體移動到顯微鏡上進行成像。培養皿提供了一個非常簡單的構建環境，適合大型構建和測試。孔板為檢測提供方便的分選。每種類型的行業標準部件配合使用。事實上，Allevi 1 和 Allevi 3 平臺中的自動校準功能經過編程，可以補償制造商的支撐構建表面深度，從而確保的校準和打印體驗。
弓形和曲率
一些建筑表面在其底部表現出彎曲或凸拱。這可能會給擠出生物打印帶來問題，因為材料沉積是分層發生的。如果構建表面的一個點高于另一個點，則存在低通或高通不沉積的風險。
玻璃與塑料
雖然大多數培養皿和孔板都是塑料的，但玻璃是一種可以帶來好處的替代品。玻璃具有更高的耐溫性和耐化學性，而某些塑料可能會與某些生物墨水中使用的有機溶劑發生反應。玻璃的彎曲程度也較低。然而，在相同的尺寸下，玻璃更重、更昂貴。此外，碎玻璃會造成危險。您可以在其中任何一個上涂上細胞友好型涂層。對于某些粘性物質的打印，兩者都可能過于光滑而無法沉積。在這種情況下，您可以使用不同的打印表面來增加表面的摩擦力。
基材剛度
細胞在仿生環境中存活得好。因此，細胞環境的幾何形狀和應力分布會影響細胞活力和分化。為了從您的細胞中獲得良好結果，在構建表面引入額外的結構可能會有所幫助，以改變普通載玻片、板或培養皿的條件。
加熱/冷卻
組織工程中常使用的哺乳動物細胞受益于保持在接近哺乳動物體溫的溫度范圍內。為了幫助重現這種效果，Allevi 3 系統有一個加熱床板，可以升高到高達 60°C 的溫度。 這對于較長的打印件特別有用。
有些材料對溫度非常敏感，結構的機械性能可能會受到構建環境中保持的溫度的影響。對于某些材料，如膠原蛋白，在溫度受控（冷）的房間中進行打印可能會有所幫助。對于其他材料，建筑表面的不同溫度可能足以引起熱交聯，從而增加建筑的結構完整性。
3D生物打印是3D打印在活細胞、生物分子和生物材料圖案化中的應用。它允許對細胞環境變量進行微觀控制，并對結構幾何形狀進行宏觀控制。這很重要，因為人體中的細胞在三維的環境中發揮作用。重新創造這種環境使人們能夠使用更具生理相關性的活組織模型。本文概述了經驗豐富的研究人員用于進行實驗并為他們的進一步研究提供信息的基本知識，重點是基于微擠出的 3D 生物打印。
選擇細胞類型
要使用的細胞類型或細胞系將決定打印過程其余部分的許多限制。一些組織，如皮膚和肌腱，已經相當容易地生長成堅固的結構。其他的，如神經組織，可能很難處理。在細胞系的臨床相關性和易用性之間取得平衡非常重要。您可能還需要考慮細胞的成熟度和來源。您的研究是否需要人類和非人類細胞之間的明確對比？您是否需要確保某種類型的人體組織在您的結構中工作？您是要打印一個模型生物系統，該模型系統需要發育的組織，還是需要證明您的工作可以促進細胞生長和分化？
或者，您選擇的細胞系可能取決于您使用的墨水。例如，您可能有一種非常厚的新型墨水，需要相對較高的力才能擠出。像神經細胞這樣的脆弱細胞對于這種墨水的實驗來說可能是一個糟糕的選擇。
細胞培養是在受控的實驗室環境中培養細胞的過程。這是3D生物打印的一個重要方面，因為生物打印研究需要許多細胞。細胞培養通常從從相關細胞系購買細胞開始。
一旦您為您的目標選擇了合適的細胞，您可能需要將您購買的樣品培養成足夠大的批量，以便在生物打印實驗中使用。 對于載有細胞的生物墨水，細胞濃度范圍為每毫升生物墨水 1-10 萬個細胞。單個生物打印實驗很容易需要 50 萬個細胞。 在我們的指南中閱讀更多關于細胞密度的信息 選擇正確的細胞數量.
要為生物打印選擇合適的細胞密度，您先需要考慮您的應用和您想要進行的終檢測。本文將幫助您確定生物墨水的細胞密度。
體內細胞密度
身體的每個器官都有特定的細胞密度，但準確估計這個值并不容易。基于免疫細胞化學、DNA含量測量或數學計算有不同的方法[1]。例如，肝臟估計含有 1.3×1081克組織中的細胞[2]。這與體外細胞培養的平均細胞密度（約1×10）截然不同 5細胞/cm2更重要的是，組織密度是動態的，在生物體的發育過程中以及致病過程中可能會發生變化。
體外細胞密度
初接種在給定體外系統中的細胞數量會對培養結果產生重大影響。基因表達、分化、增殖和細胞凋亡的密度依賴性調控是該方程式中的關鍵要素。具體參數將因細胞類型而異。 例如，已知癌細胞缺乏接觸抑制機制，使它們能夠以相對較高的密度生長而不會減少增殖[4,5]。細胞培養物的密度也會影響藥物的積累，導致對測試化合物的不同反應[6]。鑒于所有這些事實，應優化和選擇細胞密度，以在功能和生理上模仿天然組織。
生物學考慮
先，問自己以下問題：
您試圖模仿的組織天然成分是什么？
您正在使用的細胞是增殖還是有絲分裂后？
您打算將構建體在細胞培養物中保留多長時間？
由于缺乏細胞間相互作用或生長因子分泌有限，因此細胞信號傳導刺激不足，初始細胞數量過低可能會抑制細胞生長。如果構建體被設計為在體內移植，細胞數量也是一個重要參數。生物墨水中沒有足夠的細胞會導致與宿主組織的整合不良[8]。
另一方面，從過多的細胞開始會導致增殖的快速接觸抑制、細胞簇的過度生長，從而導致缺氧條件的發展、營養流動受限或營養物質消耗迅速，并產生大量廢物堆積。后一個考慮因素尤為重要，因為通常用于 2D 培養的培養基體積不足以支持高密度 3D 細胞構建體的生長。因此，如果培養基中含有酚紅，并且觀察到培養基顏色的快速變化，則可能表明應增加培養基體積，或更頻繁地更換培養基[7,8]。高細胞濃度還可以對ECM產生、水凝膠重塑和為細胞創造合適的環境產生積極影響[9]。
機械注意事項
將細胞成分添加到您的生物材料中會改變其特性。高細胞密度會增加懸浮細胞的水凝膠的粘度[7]。更高粘度的生物墨水需要增加分配壓力，這可能會對細胞活力產生負面影響[然而，這可以通過更大的噴嘴直徑來補償]。高細胞含量也會降低水凝膠硬度[9]。這些因素將影響沉積鏈的幾何形狀及其機械強度，因此，如果需要高分辨率和長期維護結構，則應根據生物墨水的細胞密度優化打印參數[10]。
細胞數量優化
為了優化應用的細胞數量，您應該從一系列不同的密度開始。您可以在下表 1 中找到一些 Allevi 作者在其出版物中使用的單元格編號。如果您打算使用類似的細胞和生物材料組合，這是一個很好的起點。
為獲得終結果，請進行簡單的生物相容性研究，包括生物墨水中幾種濃度的細胞。先研究初始和終點細胞的活力和增殖。稍后，您可以更詳細地檢查功能結果。這將取決于您的實驗，但請考慮終目標以及您的構建體應該反映什么：正確的藥物反應、遵循體內發育或表達一些所需的標記物。對于終的生物打印，請記住調整打印條件以保持高細胞活力和分辨率。
