国产一级a毛一级a看免费视频,久久久久久国产一级AV片,免费一级做a爰片久久毛片潮,国产精品女人精品久久久天天,99久久久无码国产精品免费了

一、 實驗儀器與試劑

表格一：實驗儀器

儀器	廠家	型號
小型垂直電泳槽	Biorad	164-8001
轉印槽	Biorad	Trans-Blot
脫色搖床	常州澳華	TY-80B
電泳儀	上海天能	EPS-200
低溫高速離心機	64R	BECKMAN
酶標儀	Thermo Scientific	Multiskan Spectrum

 

表格二：試劑

試劑	廠家
RIPA 裂解液	碧云天
PMSF	Amresco
BCA 蛋白定量試劑盒	Thermo
Tris	Amresco
甘氨酸	Amresco
鹽酸	國藥集團
甲醇	國藥集團
Tween 20	國藥集團
SDS	國藥集團
TEMED	Sigma
BSA	Sigma
PVDF 膜	Millipore
HRP 標記的羊抗小鼠二抗	聯科生物
化學發光檢測試劑	Thermo
GAPDH 鼠單克隆抗體	聯科生物
預染蛋白 marker	碧云天
X 光膠片	柯達

 

二、 實驗步驟

1、組織中蛋白上清液的制備和濃度測定

把組織剪切成細小的碎片；

加入 200μL 裂解液，在勻漿機中研磨，直至裂解液中組織消失；

充分裂解后，12000rpm 離心 5min，取上清。

取部分上清蛋白用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按如下步驟：  ①按試劑盒說明書將 A 液和 B 液以 50：1 的比例配制成工作液；

②取 2000μg/mL 的 BSA 標準品，用 PBS(pH 7.4)稀釋成 2000μg/mL、1500μg /mL、1000μg/mL、

750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL 共 9 個濃度梯度；

③取上清液 10μL，用 PBS 稀釋 20 倍；

④每管中加 20μL 蛋白標準品或稀釋后的上清液，再加上述工作液 0.2mL，37℃孵育 30min，

562nm 處測吸光度，記錄 OD 值；

⑤根據蛋白標準品的濃度及相應 OD 值繪制標準曲線：

根據標準方程計算樣品總蛋白濃度（mg/mL）

樣品	1	2	3	4	5	6	7	8	9
OD 值	0.817611	0.438412	0.657716	0.675617	0.362568	0.817774	0.688089	0.477546	0.627511
	0.991314	0.517018	0.814846	0.748083	0.460470	0.622999	0.574448	0.404516	0.700393
均值	0.904462	0.477715	0.736281	0.711850	0.411519	0.720386	0.631268	0.441031	0.663952
濃度
mg/mL	21.46	9.27	16.66	15.96	7.38	16.21	13.66	8.22	14.59

 

2、Western-Blot 檢測總蛋白中目的蛋白表達。

灌膠

①蒸餾水清洗灌膠玻璃板，豎直晾干。

②配制 13％分離膠 10mL，加 TEMED10μL、10％過硫酸銨 100μL，混勻后立即灌膠，灌至齒梳下緣 2～3mm（事先做好標記），用異丙醇封閉液面以去除氣泡并隔絕空氣，室溫靜置 45min 待膠*聚合。

③待分離膠*聚合后，傾去其頂部的去離子水，用濾紙將水吸干。

④配制 4％濃縮膠 5 mL，加 TEMED 5 μL、10％APS 50 μL，混勻立即灌膠，灌至頂部，并垂直插入 Teflon 齒梳，室溫靜置 20 min 待膠聚合。

⑤待膠*聚合后拔出梳子，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，用電泳緩沖液沖洗上樣孔以去除氣泡。

電泳

①取各個處理組蛋白提取液，調整蛋白濃度為 6μg/μL，和等體積 2×上樣緩沖液混合，即為上樣液。

②將上樣液于 100℃沸水中煮沸 5min，使蛋白變性，冰上驟冷，3000 轉/min 離心 1min。

③每孔加上樣液 15μL，留一孔加 10μL 預染的 Marker。加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用 80v 恒壓電泳，約 20min，當指示劑溴酚藍進入分離膠后改用 110v 恒壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約 0.5cm 處時關閉電源，取出膠板。

轉印蛋白及免疫檢測

①在電泳即將結束前，預先將 PVDF 膜浸泡在甲醇中 15s，然后用 ddH2O 漂洗 2min，浸泡于轉移緩沖液中 5min 后開始后續操作。

②在水中撬膠，修膠后將膠浸泡于轉移緩沖液中平衡 15min。

③按黑面（負極）→海綿→濾紙→膠→PVDF 膜→濾紙→海綿→紅面（正極）的順序制備轉膜“三明治”，每層鋪好后先趕走氣泡再鋪另一層。在轉移緩沖液中制備三明治可避免氣泡的產生。

④接上正負極，按膜向正極的方向將轉移盒放入電轉儀中，加入轉膜緩沖液。

⑤將電轉儀置于冰水中，100V 恒壓轉膜 1h。

⑥轉膜結束后，快速取出 PVDF 膜，放入 5%BSA 室溫封閉 2h。

⑦取出膜，于搖床上用 TBST 洗膜 5min×3 次。

⑧孵育袋中加入 TBST 稀釋的一抗（1：500）4℃孵育過夜。

⑨TBST 洗膜 5min×3 次，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠二抗（1：3000），室溫孵育 1h。

⑩TBST 洗膜 10min×3 次。膜于化學發光檢測試劑反應至暗處出現亮條帶，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好 PVDF 膜，暗室中用 X 膠片感光、顯影、定影。