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高通量水平細胞間相互作用自動分析系統(tǒng)
評估細胞激活、殺傷和運動間的變化
一可同時評估單個細胞如何移動、激活、相互作用、殺死和生存的單細胞技術(shù)
高通量單細胞水平細胞間相互作用自動分析系統(tǒng)
高通量水平細胞間相互作用自動分析系統(tǒng)
該平臺提供了對單個細胞如何移動、行為、交互和表現(xiàn)的高通量評估
了解哪些細胞表現(xiàn)佳以及原因
評估細胞激活、殺傷和運動間的變化
一可同時評估單個細胞如何移動、激活、相互作用、殺死和生存的單細胞技術(shù)
科學(xué)家依靠該系統(tǒng)平臺量化數(shù)千個免疫細胞的時空性能，以了解哪些候選細胞進入臨床試驗、了解臨床反應(yīng)并保持生產(chǎn)的一致性
提供單細胞的面、動態(tài)分析。研究細胞活動的其他方法缺乏將動態(tài)細胞行為與單細胞水平的分子行為整合的能力。該納米孔網(wǎng)格延時成像顯微鏡平臺應(yīng)用視覺 AI 來評估細胞激活、殺傷和運動作為時間的函數(shù)，以便大限度地了解細胞功能、狀態(tài)和表型。
平臺廣泛適用于各種細胞類型和應(yīng)用。雖然生命科學(xué)研究人員受益于單細胞分析的重大，但該系統(tǒng)超越了靜態(tài)分析。通過該系統(tǒng)，生命科學(xué)創(chuàng)新者可以觀察新的生物學(xué)，并對細胞如何移動、激活、殺死和生存獲得新的、意想不到的理解。
納米阱網(wǎng)格是一種廣泛適用的、實用的方法，用于記錄體外動態(tài)細胞-細胞相互作用，提供了廣泛統(tǒng)計采樣所需的大量吞吐量。重要的是，當圖像分析揭示出特別感興趣的細胞時，它們的坐標是足夠的，可以使機器人檢索用于克隆擴增或PCR等下游處理。在癌癥免疫zhi療的背景下，該方法可以監(jiān)測效應(yīng)器介導(dǎo)的對所需靶細胞的細胞毒性，而無需靶細胞工程。這提供了重要的優(yōu)勢，例如使用自體或匹配/原代腫瘤細胞作為靶細胞的能力。
該系統(tǒng)從納米阱網(wǎng)格中細胞的高通量延時成像顯微鏡數(shù)據(jù)中自動分析細胞-細胞相互作用，為免疫療法中的細胞-細胞交互作用提供了基本見解。
該系統(tǒng)廣泛適用于一般免疫學(xué)、細胞生物制造、癌癥生物學(xué)、分化、干細胞工程、基于血液中不同細胞類型之間相互作用的藥物篩選中動態(tài)細胞-細胞相互作用的高通量定量研究。
該系統(tǒng)執(zhí)行大規(guī)模自動化視頻陣列分析。它提供了一個快速的“交鑰匙"解決方案，具有高效的用戶界面，以單細胞分辨率生成細胞相互作用行為的定量分析，
具有高產(chǎn)量、自動化、速度和準確性，并具有高效的視覺確認。
它使用了利用納米阱空間限制的分割和跟蹤算法，實現(xiàn)了98%以上的細胞檢測、分割和跟蹤精度，而這些精度是無法直接實現(xiàn)的。該系統(tǒng)在集中式服務(wù)器上運行，
需要在服務(wù)器之間進行耗時的數(shù)據(jù)傳輸。
它自動計數(shù)每個納米井中的細胞，根據(jù)細胞類型標記識別細胞類型，并提供細胞大小、位置、形狀和運動的動態(tài)測量；細胞-細胞接觸的頻率和持續(xù)時間，
以及細胞事件熒光標記物的變化。它實現(xiàn)了這些測量的鏈接可視化和分析，并具有快速編輯功能。為了實現(xiàn)下游統(tǒng)計分析和假設(shè)測試，我們軟件中的數(shù)據(jù)可以以電子表格的形式導(dǎo)出
工作流程：
從客戶處收到冷凍保存的效應(yīng)細胞和靶細胞后，該系統(tǒng)解凍并進行細胞系活力研究。還可以運行客戶特定的檢測，以確保細胞以預(yù)期的方式表現(xiàn)。此時，執(zhí)行其單細胞工作流程如下：
DISCover 工作流程
TIMING分析使該系統(tǒng)能夠識別感興趣的細胞以進行進一步分析，從而更面地了解細胞的行為方式。
直觀地評估細胞間的表現(xiàn)和相互作用的情況
納米孔網(wǎng)格延時成像顯微鏡 (TIMING) 應(yīng)用基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的檢測來評估數(shù)千個單個細胞與細胞的相互作用
表征數(shù)千個細胞的遷移、接觸動力學(xué)和細胞死亡
該系統(tǒng)應(yīng)用人工智能并行進行數(shù)千個顯微鏡實驗，以高通量和單細胞分辨率表征遷移、細胞間相互作用、細胞毒性、存活和生物分子分泌
將運動和性能與多組學(xué)分析相結(jié)合
可以識別和檢索感興趣的細胞，將功能分析與單細胞 RNA 測序和流式細胞術(shù)等分析方式的信息聯(lián)系起來，從而提供對細胞功能、狀態(tài)和表型的面了解。
高通量水平細胞間相互作用自動分析系統(tǒng)
CellChorus 平臺是可以將高通量下單個細胞的運動、接觸、殺傷、細胞因子分泌和其他動態(tài)讀數(shù)與單個細胞和細胞間相互作用隨時間關(guān)聯(lián)起來的方法。 這種方法稱為動態(tài)單細胞分析。 該平臺在抗體、細胞療法、疫苗和其他技術(shù)方面有著廣泛的應(yīng)用，如《血液》、《臨床癌癥研究》、《自然免疫學(xué)》、《JITC》、《免疫學(xué)雜志》和《科學(xué)進展》等期刊的出版物所示。
專為實體瘤設(shè)計的 ROR1 特異性 CD3 雙特異性 T 細胞接合劑，具有擴大的治療窗口
2022 年 11 月 7 日
在不到 18 個月的時間里，F(xiàn)useBio 團隊開發(fā)了一種針對 ROR1 的 TCE 主要候選藥物（FUSE394）。 SITC 2022 上公布的數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)USE394 非常有效，并成功地將抗腫瘤活性與細胞因子釋放和 T 細胞耗竭脫鉤。 來自 CellChorus 早期訪問計劃的時序數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)USE394 保留了 T 細胞運動性和健康的形態(tài)，并比非解耦對照促進了 50% 的突觸形成。
基于 KIR 的抑制性 CAR 克服了 CAR-NK 細胞吞噬作用介導(dǎo)的自相殘殺和腫瘤逃逸
2022 年 9 月 29 日
研究人員應(yīng)用 TIMING 平臺以單細胞分辨率測試 NK 介導(dǎo)的細胞毒性，作為研究的一部分，表明自然殺傷 (NK) 細胞中的嵌合抗原受體 (CAR) 激活促進了 CAR 同源抗原從腫瘤轉(zhuǎn)移到 NK 細胞，從而產(chǎn)生 (1) 降低腫瘤抗原密度，從而損害 CAR-NK 細胞與其靶標結(jié)合的能力，以及 (2) 誘導(dǎo)自我識別和持續(xù) CAR 介導(dǎo)的結(jié)合，導(dǎo)致表達抗原的 NK 細胞自相殘殺。 NKTROG+) 和 NK 細胞反應(yīng)低下。
多維單細胞分析確定了 CD2-CD58 相互作用在臨床抗腫瘤 T 細胞反應(yīng)中的作用
2022 年 7 月 26 日
研究人員應(yīng)用 CellChorus TIMING 平臺評估數(shù)千個腫瘤細胞與將被輸注到患者體內(nèi)的 CAR-T 細胞之間的相互作用，以預(yù)覽輸注給患者的 CAR-T 細胞如何在輸注后腫瘤細胞。 研究人員通過機器人選擇超級殺傷性 T 細胞進行轉(zhuǎn)錄分析，以表征具有腫瘤最佳功能的 CAR-T 細胞的分子特性。
多維單細胞分析揭示 T 細胞對表達 CD19 的惡性腫瘤的潛力
2022 年 6 月 30 日
納米孔網(wǎng)格中的延時成像顯微鏡（TIMING）分析顯示，來自應(yīng)答者的 T 細胞表現(xiàn)出遷移（至少一個身體長度的持續(xù)運動），并且遷移與連續(xù)殺傷能力相關(guān)。 此外，共聚焦顯微鏡顯示遷移與線粒體體積和溶酶體體積線性相關(guān)。 scRNA-seq 證明，來自應(yīng)答者的 T 細胞在與 T 細胞殺傷、遷移和肌動蛋白細胞骨架以及 TCR 聚類相關(guān)的通路中富集。
針對保守的 SARS-CoV-2 刺突表位的細胞毒性 T 淋巴細胞是有效的連環(huán)殺手
2022 年 3 月 17 日
通過同時評估 T 細胞和攜帶病毒衍生肽的靶細胞之間的數(shù)千個單獨相互作用，該公司的人工智能驅(qū)動的 TIMING？ 平臺揭示了個體 T 細胞具有基于殺傷、連續(xù)殺傷和分泌細胞因子干擾素γ (IFNγ) 的多功能性。
水楊酸誘導(dǎo)人細胞中 NPR1 融合蛋白的核質(zhì)穿梭
2021 年 10 月 4 日
應(yīng)用納升孔中的延時成像來了解單細胞水平的易位動力學(xué)并能夠跟蹤相同的單個細胞。 微網(wǎng)格陣列包含納升孔，可以動態(tài)成像蛋白質(zhì)易位。
通過多維單細胞分析設(shè)計改進 T 細胞免疫療法
2021 年 3 月 15 日
理解為什么只有一些 T 細胞能夠殺傷細胞，并確定可以改善殺傷作用的機制仍然難以捉摸。 這些結(jié)果表明，雖然非殺傷性 T 細胞反映了群體異質(zhì)性，但綜合單細胞分析可以識別增強殺傷性 T 細胞功能/增殖的機制，從而產(chǎn)生直接的抗腫瘤益處。
將全基因組 CRISPR 免疫篩選與多組學(xué)臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，揭示了不同類別的腫瘤內(nèi)在免疫調(diào)節(jié)因子
2021 年 2 月 16 日
使用延時成像顯微鏡在單細胞水平上監(jiān)測 T 細胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷，以便更全面地了解研究中的殺傷動力學(xué)，這些研究揭示了兩種不同類型的免疫抵抗調(diào)節(jié)劑，并證明了它們作為治療靶點的潛力，以改善 immunity therapy的療效。
回顧：免疫學(xué)單細胞技術(shù)的進展
2020 年 8 月 11 日
T 細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞以及 NALM6、K562 和 EL4 等靶細胞在 PDMS 納米孔陣列中孵育，并使用延時熒光顯微鏡進行成像。 所提出的細胞分割和跟蹤算法允許自動量化細胞對、細胞位置、形態(tài)、相互作用和運動以及細胞活力，而不需要手動處理。 結(jié)果表明，在突觸形成之前和過程中，細胞毒性 T 細胞比非細胞毒性 T 細胞具有更高的運動性。
單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定了 TCR 和 CD8αβ 工程人類 CD4+ T 細胞抗腫瘤功能的多種途徑
2020年7月3日
我們發(fā)現(xiàn)細胞毒性、共刺激、氧化磷酸化和增殖相關(guān)基因持續(xù)激活，同時減少分化和耗竭。 我們的研究確定了 TCR8 表達的分子特征，可以指導(dǎo)增強免疫療法的開發(fā)。
無論 CD19 表達如何，CAR T 細胞都能靶向急性 B 系白血病
2020 年 3 月 24 日
CD19/20/22CAR T 細胞在體外和動物模型中均能殺死 CD19CAR T 細胞治療和 CRISPR/Cas9 CD19 敲除原發(fā)性 BL-ALL 后復(fù)發(fā)患者的 CD19(?) 母細胞，而 CD19CAR T 細胞則無效 。 在亞細胞水平上，CD19/20/22CAR T細胞與靶細胞形成致密的免疫突觸，介導(dǎo)有效的細胞溶解復(fù)合物形成，是單細胞追蹤研究中有效的連環(huán)殺手，并且與針對原代CD19的CD19CAR T細胞一樣有效 (+)疾病。 總之，與 CD19 表達無關(guān)，CD19/20/22CAR T 細胞可用作頑固性疾病患者的挽救或一線 CAR 療法
Phasetime：在延時相位圖像中檢測原子核的深度學(xué)習(xí)方法
2019 年 8 月 2 日
通過利用傳統(tǒng)的斑點檢測從染色通道圖像生成二進制掩模標簽和深度學(xué)習(xí) Mask RCNN 模型來訓(xùn)練檢測和分割模型，我們成功地僅基于相位圖像來分割原子核。 當IoU閾值設(shè)置為0.5時，檢測平均精度為0.82。 由相位圖像生成的掩模和專家提供的地面真值掩模的平均 IoU 為 0.735。 在訓(xùn)練期間沒有任何真實掩模標簽，這足以證明我們的假設(shè)。 這一結(jié)果使得無需外源標記即可檢測細胞核的能力。
使用膠囊網(wǎng)絡(luò)在相差顯微鏡中自動分類細胞凋亡
2019 年 5 月 22 日
本文提出了一種高效的膠囊網(wǎng)絡(luò)變體 (CapsNets) 作為 CNN 的替代方案。 大量的實驗結(jié)果表明，所提出的 CapsNet 在目標細胞凋亡分類方面具有競爭性的性能，同時在訓(xùn)練樣本數(shù)量較少時顯著優(yōu)于 CNN。 為了利用顯微鏡視頻中的時間信息，我們提出了一種通過堆疊 CapsNet 和雙向長短期循環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建的循環(huán) CapsNet。 我們的實驗表明，在考慮時間約束時，循環(huán) CapsNet 的準確率達到 93.8%，并且做出的預(yù)測比神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)更加一致。
多維單細胞分析揭示CAR+ T細胞抗腫瘤功效
2019 年 5 月 1 日
轉(zhuǎn)錄組分析、免疫表型和代謝的整合表明，運動細胞更加幼稚，具有更高的氧化代謝和備用呼吸能力。 我們的結(jié)果還表明，主代謝調(diào)節(jié)因子 AMP 激酶 (AMPK) 是具有高運動能力的 CAR+ T 細胞所必需的。 我們使用異種移植白血病小鼠模型（CD19+ NALM-6）并驗證，與親本未分選群體相比，運動細胞在體內(nèi)具有增強的持久性和*的抗癌效果。 總的來說，我們的多維結(jié)果表明，持續(xù)運動是擴展 CAR+ T 細胞生物活性的可選擇生物標志物。
TIMING 2.0：通過納米孔網(wǎng)格中的延時成像顯微鏡對動態(tài)細胞間相互作用進行高通量單細胞分析
2019 年 2 月 15 日
在臺式計算機上，TIMING 2.0 需要 5 秒/塊/圖像幀，比我們之前在同一計算機上運行的方法快四倍，比我們之前在 Dell PowerEdge 服務(wù)器上運行的方法 (TIMING) 快兩倍。 細胞分割精度（f-number？=？0.993）優(yōu)于我們之前的方法（f-number？=？0.821）。 圖形用戶界面提供了檢查視頻分析結(jié)果、高效進行校正編輯（在 5-10 秒內(nèi)一鍵編輯整個納米井視頻序列）并顯示細胞殺傷功效測量摘要的能力。
定義 CAR+ T 細胞的效力：快速而激烈還是緩慢而穩(wěn)定
2018 年 5 月 7 日
表達嵌合抗原受體 (CAR+) 的基因工程 T 細胞具有異質(zhì)性，因此了解immunity therapy功效仍然是過繼細胞療法中的一個挑戰(zhàn)。 我們開發(fā)了一種高通量單細胞方法，即納米井網(wǎng)格延時成像顯微鏡 (TIMING)，用于在體外監(jiān)測免疫細胞和腫瘤細胞之間的相互作用。 使用 TIMING，我們證明 CD4+ CAR+ T 細胞參與多重殺傷，并受益于與 CD8+ CAR+ T 細胞相比，對激活誘導(dǎo)的細胞死亡的更好的抗力。 對于這兩個細胞亞群，單細胞水平
的效應(yīng)細胞命運取決于多個腫瘤細胞的功能激活。
用于分析 T 細胞以監(jiān)測免疫療法的單細胞技術(shù)
2018 年 3 月 6 日
以單細胞分辨率全面了解 ICI 或過繼細胞移植 (ACT) 中 T 淋巴細胞的多功能性，將量化對治療效果至關(guān)重要的 T 細胞特性。 我們簡要介紹了幾種新興的集成單細胞技術(shù)，重點關(guān)注 T 細胞的多種特性/功能的分析。 我們預(yù)計這些工具有可能為 T 細胞生物學(xué)提供有價值的實驗和臨床見解，并最終為發(fā)現(xiàn)用于immunity therapy的替代 T 細胞生物標志物鋪平道路。
BTLA 在抗原遭遇后控制 CD8 + T 細胞命運中的多方面作用
2017 年 10 月 15 日
CD8+BTLA-TIL 不能控制體內(nèi)腫瘤生長，其 BTLA+ 對應(yīng)物和抗原特異性 CD8+BTLA-T 細胞也損害了對疫苗的記憶反應(yīng)。 然而，CD8+BTLA+ TIL 在殺死腫瘤靶標后表現(xiàn)出更高的存活率，并增強了“連環(huán)殺傷"能力。 利用 BTLA 信號基序的突變體，我們發(fā)現(xiàn)了 Grb2 通過增強 TCR 刺激后 IL-2 的分泌和 Src 的激活而介導(dǎo)的共刺激功能。 我們的數(shù)據(jù)將 BTLA 描述為一種分子，具有向激活的 CD8+ T 細胞提供共刺激和共抑制信號的能力，從而延長生存期、改善腫瘤控制并產(chǎn)生功能性回憶反應(yīng)。 臨床癌癥研究； 23（20）； 6151-64。 2017 AACR 。
結(jié)合 C1q 但不結(jié)合效應(yīng) Fcγ 受體的 IgG Fc 結(jié)構(gòu)域描繪了補體介導(dǎo)的效應(yīng)功能的重要性
2017 年 9 月 19 日
我們使用工程化的 Fc 結(jié)構(gòu)域在體外和小鼠模型中證明，對于治療性抗體，補體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性 (CDCC) 和補體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用 (CDCP) 是由免疫效應(yīng)分子介導(dǎo)的靶細胞清除作用 其動力學(xué)和功效與經(jīng)過更好研究的 FcγR 依賴性效應(yīng)器功能相當，同時它們避免了與 FcγR 結(jié)合相關(guān)的某些不良反應(yīng)。 總的來說，我們的數(shù)據(jù)強調(diào)了CDCC和CDCP在單克隆抗體功能中的重要性，并提供了一種實驗方法來描述補體依賴性效應(yīng)細胞參與在各種治療環(huán)境中的作用。
動態(tài)細胞因子分泌和免疫細胞表型的單細胞分析
2017 年 8 月 24 日
對數(shù)百個人外周血 NK 細胞的離體分析表明，CD56dimCD16+ NK 細胞在被佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 (PMA) 和離子霉素激活后（< 3 小時），可立即分泌干擾素 γ (IFN-γ)， 并且沒有證據(jù)表明 NK 細胞之間的合作會導(dǎo)致協(xié)同激活或更快的 IFN-γ 分泌。 此外，我們觀察到單個 NK 細胞分泌 IFN-γ 的量和速率均依賴于供體。 總的來說，這些結(jié)果確立了我們的方法作為一種研究工具，以高通量方式將單個細胞的表型分析和實時蛋白質(zhì)分泌結(jié)合起來。
通過納米孔網(wǎng)格中的高通量延時成像顯微鏡自動分析單個細胞與細胞之間的相互作用（TIMING）
2015 年 10 月 1 日
將熒光標記的人類 T 細胞、自然殺傷細胞 (NK) 和各種靶細胞（NALM6、K562、EL4）在亞納升孔（納米孔）的聚二甲基硅氧烷陣列上共孵育，并使用多通道延時顯微鏡成像 。 所提出的細胞分割和跟蹤算法考慮了細胞變異性，并利用納米孔限制特性，將包含一個效應(yīng)器和單個靶標的孔中正確分析的納米孔的產(chǎn)率從 45%（現(xiàn)有算法）提高到 98%，從而實現(xiàn)細胞的自動定量 位置、形態(tài)、運動、交互和死亡，無需手動校對。 對 12 個不同實驗的記錄的自動分析表明，盡管照明、染色、成像噪聲、細胞形態(tài)存在變化，但使用默認參數(shù)，自動納米孔描繪準確度 >99%，自動細胞分割準確度 >95%，自動細胞跟蹤準確度為 90% 和細胞聚類。 示例分析表明，NK 細胞通過改變接合持續(xù)時間來有效區(qū)分活目標和死目標。 數(shù)據(jù)還表明，在接觸之前和接觸過程中，細胞毒性細胞比非殺傷細胞表現(xiàn)出更高的運動性。
單個活動 CD4(+) T 細胞可以通過與多個腫瘤細胞結(jié)合參與有效的多重殺傷
2015 年 5 月 1 日
我們在納米孔網(wǎng)格中實施延時成像顯微鏡 (TIMING)，以提供直接證據(jù)，證明 CD4(+)CAR(+) T 細胞（CAR4 細胞）可以通過同時綴合多個腫瘤細胞來參與多重殺傷。 CAR4細胞和CD8（+）CAR（+）T細胞（CAR8細胞）的比較表明，盡管CAR4細胞可以參與殺傷和多重殺傷，但它們的速度較慢，可能是由于顆粒酶B含量較低。 值得注意的是，在兩組 T 細胞中，通過其高運動性識別出的一小部分個體 T 細胞亞群證明了對單個腫瘤細胞的有效殺傷。 多殺傷細胞和單殺傷細胞 CAR(+) T 細胞的比較表明，T 細胞凋亡的傾向和動力學(xué)受到功能結(jié)合數(shù)量的調(diào)節(jié)。 當 T 細胞與單獨的單個腫瘤細胞結(jié)合時，T 細胞會以更高的頻率快速凋亡，這種效應(yīng)在 CAR8 細胞上更為明顯。 我們的結(jié)果表明，CAR(+) T 細胞參與多重殺傷的能力應(yīng)在其抵抗激活誘導(dǎo)的細胞死亡的能力的背景下進行評估。 我們預(yù)計 TIMING 可用于快速確定 T 細胞群的效力，并有助于設(shè)計和制造具有更高功效的下一代 CAR(+ ) T 細胞。
抗體 Fc 工程提高了 NK 細胞介導(dǎo)的連續(xù)殺傷的頻率并促進動力學(xué)增強
2014 年 11 月 20 日
我們證明，DLE-HuM195 抗體通過賦予更多的 NK 細胞通過累積的 CD16 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)參與細胞毒性并增加對靶細胞的連續(xù)殺傷，從而提高 NK 細胞介導(dǎo)的抗體依賴性細胞毒性的質(zhì)量和數(shù)量。 NK 細胞遇到 DLE-HuM195 包被的靶標時，會通過促進與多個靶細胞同時綴合來誘導(dǎo)快速靶細胞凋亡，并在與野生型 mAb 相同的時間內(nèi)誘導(dǎo)兩倍數(shù)量的靶細胞凋亡。 增強的靶標殺傷也與 NK 細胞凋亡頻率增加有關(guān)，但這種效應(yīng)是供體依賴性的。 針對腫瘤抗原的抗體療法將受益于對細胞介導(dǎo)的腫瘤消除的更好理解，我們的工作為 CD33 治療急性髓系白血病的治療靶向提供了更多機會。
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