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質(zhì)粒提取科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：137 發(fā)布時(shí)間：2024-9-20
應(yīng)用簡(jiǎn)介
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。
技術(shù)原理
質(zhì)粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑(如Triton和SDS)裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒(<15kb)。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒(>15kb)。堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA的片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，離心去除沉淀后，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。目前，市面上質(zhì)粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，然后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來(lái)。得到的質(zhì)粒可以用于酶切、PCR、測(cè)序、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)方法
1、時(shí)間控制問(wèn)題
裂解時(shí)間太長(zhǎng)，加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘；吸附時(shí)間不夠；溶解時(shí)間不夠都會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)失敗。
2、質(zhì)粒拷貝數(shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。
3、溶液使用不當(dāng)
溶液P2、P3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
4、吸附柱過(guò)載
不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或者×YT菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長(zhǎng)率，則需調(diào)整LB培養(yǎng)液體積。
5、質(zhì)粒未全部溶解
洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。
6、乙醇?xì)埩?br/> 漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。
7、洗脫液加入位置不正確
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)wan全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。
8、洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.0～8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過(guò)低可能性導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至60℃后使用有利于提高洗脫效率。