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在干燥過程中，蛋白質的水合層被除去，這時，“優先作用"機理已不再適用。在干燥過程中的保護機理，目前主要有兩大觀點：（1）玻璃態假說；（2）水替代假說。

1） 玻璃態假說

     這種觀點認為在含有保護劑溶液的干燥過程中，當濃度足夠大且保護劑不發生結晶時，保護劑與活性組分混合物就會形成玻璃態。這種玻璃態的形成可以使得凍干品的黏度達到1012Pa.s，這也是玻璃態的黏度。保護劑在蛋白質周圍形成玻璃體，使大分子蛋白質的鏈段運動受阻，阻止蛋白質的展開和沉淀，從而抑制了蛋白質結構亞能級與結構松弛之間的相互轉換，維持蛋白質分子三維結構的穩定性。

2）水替代假說

     由于蛋白質分子中存在大量的氫鍵，結合水通過氫鍵與蛋白質分子聯結。當蛋白質在冷凍干燥過程中失去水分后，保護劑的羥基能夠替代蛋白質表面上水的羥基，使蛋白質表面形成一層“水合層"，這樣就可以保護氫鍵的聯結位置不直接暴露在周圍環境中，從而保持了蛋白質天然結構和功能的完整性。

目前許多研究者比較贊同“水替代假說"的觀點，這主要是因為通過傅立葉紅外線頻譜儀（FTIR）對蛋白質分子的結構以及蛋白質與保護劑之間的氫鍵作用進行直接檢測，為該理論提供了證據。