NGS工作流程通常從樣品制備步驟開始，其成功與否對確保可靠的測序結果至關重要。為了獲得足夠數量和質量的核酸，需要對樣品進行有效和均勻的研磨。機械裂解，更具體地說是珠磨式技術，被認為是樣品研磨均勻化的黃金標準。
NGS工作流程可以分為這三步：
文庫制備：為了節省資源，可以將多個文庫混合在一起，在同一運行中進行測序——該過程稱為多重分析。接頭連接過程中，標簽序列（或說“條形碼”）會添加到每個文庫。這些條形碼可以在數據分析過程中區分文庫。這步是為獲取足夠量的/目的的/前期適合上機測序而標準處理DNA。其程序主要有：片段化，連接，擴增。
測序：在邊合成邊測序（SBS）過程中，化學修飾的核苷酸會通過天然的互補性與DNA模板鏈結合。每個核苷酸都有一個熒光標記和一個可逆終止子，后者可以阻止下一個堿基的摻入。熒光信號可以指示出加入的核苷酸種類，終止子被切割后，下一個堿基才可以繼續結合。其實就是把把采集到的樣品分離提純成需要的基因組DNA，再把這些DNA打成小片段，然后再在這些DNA小片段兩頭接上識別標記和測序接頭，最后再通過基因捕獲技術篩選出目的DNA，根據需求PCR擴增。然后，就可以上機測序了。上機測序的過程就是讀取這些。
數據分析：可以使用直觀的數據分析應用程序來分析NGS數據，無需進行生物信息學培訓或另外雇傭實驗室人員。這些工具可以進行序列比對、變異檢出、數據可視化或解讀。
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