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超聲波破碎儀在破碎大腸桿菌時(shí)的技巧
超聲波破碎儀在破碎大腸桿菌時(shí)的技巧
破碎大腸桿菌用于提取表達(dá)外源蛋白，在使用超聲波破碎儀之前，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然后再破碎效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對其他的一些細(xì)菌同樣起作用，比如鏈霉菌。
細(xì)菌沉淀直接加樣品1buffer，再加5μl的巰基乙醇，混勻，離心，煮沸10min，直接上樣，染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當(dāng)補(bǔ)點(diǎn)醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來水即可)在微波爐煮10min 就可以。在表達(dá)重組蛋白后用超聲波破碎細(xì)胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一會(huì)就產(chǎn)生大量泡沫，影響了破碎功率，pbs和tris緩沖液都是這樣，zui后都是破碎不*，而我的目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中。
1、會(huì)產(chǎn)生氣泡是因?yàn)槟愕奶筋^位置沒放好。超聲波破碎儀探頭一定要接近底部，約1cm（推薦是距底部0.5mm）。功率根據(jù)儀器不同會(huì)有所不同，但你可以觀察液面，有波動(dòng)但不要太劇烈就好。
2、破3s停10s，破碎20-30個(gè)循環(huán)觀察效果。
3、探頭位置擺放也要注意，聽聲音如果不對的話就要及時(shí)調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。在使用超聲波破碎時(shí)試著加大體積,振幅不要超過60%.
4、嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說，通常方法很難散熱，導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，zui好停頓時(shí)間稍長一些，這種情況多見于包涵體形式的蛋白。如果換用Branson超聲波破碎儀來進(jìn)行工作，由于熱耗較小，停頓周期可適當(dāng)減小。