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技術文章

細胞實驗注意事項

閱讀:901          發布時間:2023-7-6

1、細胞復蘇

將細胞凍存管從干冰中取出,立即放置37°水浴速融1min,見無冰晶即可不再水浴(用鑷子拿?。?/p>

將細胞凍存液加入10~15ml完培中,吹打混勻,減少DMSO對細胞毒性,800rpm離心5min

棄上清,細胞沉淀進行下一步傳代。


2、細胞傳代

試劑與材料(貼壁細胞):

細胞:4T1乳腺癌細胞;基礎培養基:1640培養基(含有生物素、 維生素 B12、對氨基苯甲酸PABA、高濃度的維生素肌醇和膽堿;不含有蛋白質、脂質或生長因子);血清:胎牛血清FBS(細胞營養液:提供基本營養物質、提供激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養中的細胞起到某些保護作用);胰酶(消化貼壁細胞促附著蛋白如層黏連蛋白、纖維連接蛋白等)


實驗方法:

1)試劑解凍:胰酶,培養基在37°水浴加熱解凍

2)制備培養基:1640培養基中加入10%的血清,水平搖勻,避免震搖引起泡沫

3)細胞消化:將原來培養基倒除,用500μl選擇pbs/胰酶先潤洗(消化培養基里的蛋白,避免對細胞生長產生影響),去除胰酶,再沿壁(不直接加到細胞表面)加入1ml胰酶,在37°中消化3~5min(可1min左右觀察消化情況)。

4)細胞傳代:加入3ml完培,輕柔吹打,取1/4的消化后的細胞(其余的倒掉)加至EP管,在細胞離心機上離心1000rpm 5min,離心后的細胞,輕柔放置,防止細胞混散,可傾倒除去胰酶液(留一點點液體保持細胞活性)快速加入培養基。以10CM培養皿為例:先在皿中加入7ml的培養基。在EP管中懸空加入1~2ml左右培養基(60MM皿3ml培養基;10CM皿10ml培養基),輕柔的吹打,可以沿壁混合,使黏附細胞變成單細胞;將細胞液加入至皿中,劃10次8字使皿充分被浸潤,放置37°孵育。

5)注意事項:

在進行細胞實驗前,需紫外照射生物柜30min,穿戴整齊后方可進入細胞房。

胰酶和培養基需37°水浴加熱,至適合細胞生存溫度。

開始實驗前,關閉紫外照射,打開風櫥和燈光。

開始實驗時,需要手消且所需物品需要消毒,才可放入生物柜中,臺面用酒精棉球消毒

物品擺放整齊,留出空間實驗,右手用的在右手,左手用的在左手,切勿交叉。瓶蓋用前可擰松,開口朝上或立放。每用完槍頭盒,需蓋蓋,且切勿雙手經過槍頭盒。實驗室,槍桿不要伸入瓶中或管中。

實驗結束,所用試劑需標簽;清理垃圾和廢液;帶走自己的東西;關閉燈光和通風櫥。

下一次傳代前,顯微鏡中觀察細胞生長情況,密度70%~80%左右,即可傳代。

 

試劑與材料(懸浮細胞)

thp-1(人急性白血病單核細胞)——顯微鏡觀察時,晃動皿,細胞游動;1640培養基,25培養瓶,10CM培養皿,45mlEP管

實驗方法

轉移培養皿中的細胞至45mlEP管,移液槍吹打(沿壁吹打,使之變成單個細胞)

1000rpm,離心5min ,得到細胞沉淀

快速傾倒上清液(沿細胞堆積的另一邊),保留500μl左右的液體

細胞沉淀加入4ml培養基(反復吹打),培養皿中加入7ml培養基(共10ml),25培養瓶中加入4ml培養基(共5ml)

重懸后細胞液分別移至培養皿和培養瓶中,輕微搖晃,放置37°恒溫箱

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