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谷胱甘肽的檢測手段
閱讀：2606 發布時間：2023-1-11谷胱甘肽檢測方法較多，比較常用的有碘量法、DTNB（Ellman試劑）法、亞硝基鐵氰化鈉法、熒光法、四氧嘧啶法和高效液相色譜法（ HPLC）。上述方法各有優點，在檢測GSH含量時可根據實際情況，選擇適合、靈敏、精確的檢測方法。
DTNB比色法
原理：DTNB與谷胱甘肽的巰基反應生成黃色的5 - 硫代 - 2 - 硝基苯甲酸，在412 nm波長處有最大吸收峰，而DTNB在400nm以上幾乎沒有吸收峰。向含有谷胱甘肽的試樣中加入少量的DTNB，將反應液在412 nm處測定吸收值，根據吸收值的大小即可求得谷胱甘肽含量。
方法步驟：
1、DTNB貯存液配制：將0.01 mol/L的DTNB溶解于0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）中形成DTNB貯存液。
2、DTNB分析液配制：將DTNB貯存液用0.5 mol/L、pH8.0的Tris - HCl緩沖液稀釋100倍，配成DTNB分析液，避光放置，現配現用。
3、操作步驟：取谷胱甘肽標準品溶液或待測樣品溶液（0.1 ~ 3.0 mol/L）0.5 mL，加入到1.5 mL濃度為0.15 mol/L的NaOH溶液中，再加入3%的甲醛溶液05mL，在pH8.0、25℃下反應2 min，反應結束后，取反應液0.5 mL加入DTNB分析液，在25℃下反應5 min，于波長412 nm下測定吸收值。根據兩者的吸光度，計算差值，代入標準曲線，計算出谷胱甘肽的含量。
碘量分析法
原理：利用谷胱甘肽的還原性與碘酸鉀進行反應，當谷胱甘肽wanquan反應時，碘酸鉀將碘化鉀氧化為碘，碘使淀粉指示劑變成藍色，即為滴定終點。
操作步驟：精確稱取谷胱甘肽樣品0.05 mg，放入10 mL燒杯，用2%的HPO3溶解，移入100 mL容量瓶，用水定容至100 mL。吸取上述溶液5 mL放入100 mL 三角瓶內，再加入2% HPO3液5 mL使之成為10 mL，然后向其中加入5%碘化鉀1 mL及淀粉指示劑2滴。采用0.001 mol/L的碘酸鉀滴定，以消耗0.001 mol/L碘酸鉀的數值與理論值2.445 mL一致時，則成品中谷胱甘肽含量為100%。
計算公式中，V-消耗0.001 mol/L碘酸鉀的體積（mL），2.445 -100%含量應消耗的體積（mL）。
高效液相色譜法
原理：高效液相色譜法是由于溶質在同定相和流動相之間的分配系數、親和力、分子大小、吸附能力等不同，而進行連續分離的過程。
操作步驟：
①色譜條件
色譜柱：Kromasil C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。
流動相：磷酸二氫鈉和辛烷磺酸鈉混合溶液（磷酸二氫鈉3.0 g、辛烷磺酸鈉1.0 g，加水溶解并定容至500 mL，用磷酸調溶液pH為3）：乙腈 = 96：4（體積比）。
檢測波長：210 nm，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，進樣量10UL。
②制作標準溶液
準確稱取谷胱甘肽標準品適量，用去離子水溶解于容量瓶中，混合均勻，定容，制成25 μg/mL、50 μg/mL、100 Vg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL系列濃度樣品液，作為標準溶液。
③樣品制備
準確稱取谷胱甘肽樣品，加去離子水，混合均勻，制成濃度為25 ~ 800 μg/mL的樣品溶液，作為分析溶液。
④繪制標準曲線
將配置的谷胱甘肽標準液，分別吸取10 μL進樣測定，以谷胱甘肽谷胱甘肽生產技術濃度和峰面積繪制其標準曲線，根據標準曲線得出該曲線的回歸方程。峰面積的變化應與谷胱甘肽的質量濃度呈線性關系，其擬合度應達0.9995以上。
⑤樣品的測定
取谷胱甘肽樣品分析液10 μL，用高效液相色譜儀進樣測定，得到樣品溶液的峰面積，根據回歸方程計算出谷胱甘肽的含量。