羥基自由基清除能力測試試劑盒

（A004-96T）

一、 測定原理

金屬離子與過氧化氫通過芬頓反應生成的羥基自由基（•OH），•OH攻擊脫氧核糖并破壞其環呋喃環生成丙二醛（MDA）。丙二醛與2-硫代巴比妥酸（TBA）結合后在532nm處具有大吸收峰（Halliwell等，1987，ANAL BIOCHEM）。具體反應如下：

Fe³⁺-EDTA + 抗壞血酸 → Fe²⁺-EDTA +氧化的抗壞血酸 (1)

Fe²⁺-EDTA + H₂O₂ → OH- + •OH + Fe³⁺-EDTA (2)

•OH + 脫氧核糖 → 脫氧核糖碎片  MDA (3)

MDA + 2TBA → 發色體(4)

專一的羥基自由基抗氧化劑能減少羥基對脫氧核糖的攻擊，從而減少MDA產生而使發色體減少。通過測定反應終產物的吸光值即可判斷受測樣品的羥基自由基清除能力。

二、 試劑組成

試劑一：液體，2mL；

試劑二：液體，2mL；

試劑三：液體，2mL；

試劑四：液體，2mL；

試劑五A：液體，100mL；

試劑五B：淡黃色粉末；

試劑六：液體，100mL；

標準品：體系終濃度為10mM的甘露醇（雙蒸水配制），10mL。

三、 儲存條件及有效期

試劑盒-20℃可保存1個月。

四、 試劑的配制

試劑一應用液：待試劑融化后，在試劑一瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑二應用液：待試劑融化后，在試劑二瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑三應用液：待試劑融化后，在試劑三瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑四應用液：待試劑融化后，在試劑四瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑五應用液：待試劑五A融化后，將試劑五B全部倒入試劑五A中，充分搖勻溶解（若發現不好溶解，可超聲波助溶或適當加熱。如不易觀察是否全部溶解，可將試劑五A倒入燒杯中，配制好后再倒回試劑五A瓶內，避光保存）；

試劑六：直接使用；

標準液：根據實際需要，采用雙蒸水稀釋使用。

所有試劑均需現配現用！

五、 操作步驟

充分混勻，37℃水浴30min使之充分反應。

充分混勻，100℃沸水浴15min²。

冷卻后進行比色讀數。如您具有可以測定532nm處吸光值的酶標儀，可從反應液中取出200μL于酶標板內采用酶標儀讀數；或者您也可以采用分光光度計測定532nm處吸光值。

¹如樣品顏色較淺可不做樣品空白（即認為值為0）；

²建議反應15min，也可適當延長或縮短時間至10-20min，但同一批樣品加熱時間需保持一致。

六、計算公式

注： 如未做對照孔，可以將其視作為0；

七、注意事項

1. 如樣品中色素物質不是分析對象，建議良好行脫色處理，處理后樣品可不做對照孔；

2. 如不確定樣品的羥基自由基清除能力，可先做不同濃度的稀釋液進行摸索，并選擇適宜濃度進行測定，高濃度下，濃度與清除率間并不線性相關。注意，產物的不同自由基清除能力可能相差很大，可能一個化合物的超氧陰離子自由基清除能力特別好，IC50可以低于10μg/mL，但羥基自由基清除能力很差，IC50達到10mg/mL，或者根本沒有清除能力；

3. 混勻很重要，建議每加一種試劑時均充分混勻。

4. 100℃沸水浴可采用水浴鍋或者電磁爐進行加熱。加熱時可用錫紙蓋住試管管口，并用牙簽戳一個小孔。若使用一次性離心管進行實驗，切記不可將上蓋蓋死，氣體膨脹有爆裂危險！

5. 加樣順序不可顛倒！不可將試劑一至四混勻后加入樣品；

6. 本測試盒部分試劑對皮膚有一定傷害，請戴手套操作。在沸水浴時小心蒸汽燙傷；

7. 煮沸加熱時間和溫度對本測試至關重要，請務必保證所有測試管加熱時間和溫度均相同。同時請務必等待樣品冷卻到室溫時再進行讀數測定，如需快速冷卻，可采用自來水沖洗試管外壁的方法；

8. 測定羥基自由基的方法總類繁多（Halliwell等，1988，Methods of Biochemical Analysis），同一樣品采用不同方法測定時會有一定差異，因此不同方法測定的結果不能簡單比較；

9. 本測試樣品一般不可采用有機溶劑溶解！極少量也不可以！常見的有機溶劑如乙醇等，其通過本方法得到的羥基自由基清除率*，超過許多常見抗氧化劑，不可以忽略。不可使用的有機溶劑及機理參見文獻：Xican Li, 2013, Food Chemistry.

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