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重組賴氨酰內(nèi)切酶(Lys-C)來源于無色桿菌,采用大腸桿菌重組表達(dá).重組賴氨酰內(nèi)切酶(Recombinant Lysyl Endopeptidase)是一種絲氨酸蛋白酶,可高度特異性的水解賴氨酸羧基側(cè)的酰胺、酯和肽鍵,最適的反應(yīng)pH為9.0-9.5,最適反應(yīng)溫度為30-37℃,在4M尿素或者0.1% SDS存在的情況下仍可保持較高的酶活性.這種酶在生物技術(shù)和制藥工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用,尤其是在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析和藥物研發(fā)中。
結(jié)構(gòu)與功能
賴氨酰內(nèi)切酶是一種金屬蛋白酶,通常含有鋅離子作為其活性中心的一部分。它的主要功能是識(shí)別并切割蛋白質(zhì)或多肽鏈中賴氨酸(Lys)殘基的C端肽鍵。這種特異性使得它在蛋白質(zhì)的序列分析、蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中非常有用。
生產(chǎn)方法
重組賴氨酰內(nèi)切酶的生產(chǎn)通常涉及以下步驟:
1. 基因克隆:從天然來源(如細(xì)菌、真菌或植物)中克隆編碼賴氨酰內(nèi)切酶的基因。
2. 表達(dá)載體構(gòu)建:將克隆的基因插入到表達(dá)載體中,通常是質(zhì)粒,以便在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)。
3. 宿主細(xì)胞選擇:選擇合適的宿主細(xì)胞(如大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)進(jìn)行基因表達(dá)。
4. 發(fā)酵與表達(dá):在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下,使宿主細(xì)胞大量表達(dá)(空)賴氨酰內(nèi)切酶。
5. 純化:通過一系列的純化步驟(如親和層析、離子交換層析等)從宿主細(xì)胞中分離和純化重組酶。
應(yīng)用
1. 蛋白質(zhì)測(cè)序:賴氨酰內(nèi)切酶可以用于蛋白質(zhì)的N端測(cè)序,通過特異性切割賴氨酸殘基,生成一系列的肽段,便于后續(xù)的質(zhì)譜分析。
2. 蛋白質(zhì)工程:在蛋白質(zhì)工程中,賴氨酰內(nèi)切酶可以用于修飾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),例如去除特定的賴氨酸殘基,以改變蛋白質(zhì)的功能或穩(wěn)定性。
3. 藥物研發(fā):在藥物研發(fā)過程中,賴氨酰內(nèi)切酶可以用于分析和修飾藥物靶點(diǎn)蛋白,幫助理解藥物的作用機(jī)制。
注意事項(xiàng)
- 酶的穩(wěn)定性:重組賴氨酰內(nèi)切酶的穩(wěn)定性可能受多種因素影響,如pH值、溫度和金屬離子濃度。在使用過程中需要優(yōu)化這些條件以保持酶的活性。
- 特異性:雖然賴氨酰內(nèi)切酶對(duì)賴氨酸殘基有特異性,但在復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中,可能需要結(jié)合其他分離技術(shù)(如色譜)以提高分析的準(zhǔn)確性。
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