天津本生—PCR技術原理、實驗步驟和應用

　　實驗目的

　　1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。

　　2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術。

　　二、實驗原理

　　PCR技術，即聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學獎)建立的。這項技術可在試管內的經數(shù)小時反應就將特定的DNA的片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

　　PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA的片段。細胞中DNA的復制是個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

　　PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備;

　　②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

　　③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

　　重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　三、實驗試劑與器材

　　模板DNA、2.5mmol/LdNTP

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

　　10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O

　　PCR儀、移液槍、PCR板

　　四、實驗步驟

　　1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

　　模板DNA2μL

　　引物11μL

　　引物21μL

　　dNTP1.5μL

　　MgCl22μL

　　10×buffer2μL

　　ddH2O10μL

　　Taq酶0.5μL

　　2、設置PCR反應程序。

　　3、上樣，啟動反應程序。

　　4、擴增產物的電泳檢測。

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