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登革熱IgM（捕獲法）ELISA檢測(cè)試劑的實(shí)驗(yàn)步驟
DENV Detect IgM Capture ELISA是一種用來(lái)檢測(cè)人是否感染登革熱病毒的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，它可以檢測(cè)出人血清中是否存在抗登革熱病毒源性重組抗原（DENVRA）的IgM抗體。此診斷實(shí)驗(yàn)用于有登革熱發(fā)熱或是登革熱血熱臨床癥狀的病人檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果必須經(jīng)過(guò)蝕斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）或是根據(jù)CDC疾病診斷指南確證。
實(shí)驗(yàn)步驟：
將所有的試劑成分和樣品都平衡至室溫。實(shí)驗(yàn)前反復(fù)倒置以混合試劑和樣品。
試劑準(zhǔn)備：
1）1X洗滌液的配制：用生物學(xué)或高純度水將10倍濃縮型的洗滌液稀釋成1X的洗滌液。為了制備即用型的洗滌緩沖液，我們可以將120ml 10倍濃縮的洗滌液加入到1080ml蒸餾水或去離子水中，沖洗掉所有晶體，旋渦混合溶液以至所有晶體都溶解掉。制備好的洗滌液可在室溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存6個(gè)月。使用前請(qǐng)檢查洗滌液是否被污染。
2）包被板的準(zhǔn)備：將實(shí)驗(yàn)所需數(shù)目的板條置于板架上。將剩余的板條立即裝入包裝袋中，并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
操作步驟：
1）陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控都必須做雙份檢測(cè)，DENRA和NCA都要檢測(cè)，未知血清樣品可做一份或雙份，DENRA和NCA都要檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)上的操作流程圖進(jìn)行操作。
2）將實(shí)驗(yàn)中使用的板條標(biāo)記好。
3）用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質(zhì)控品稀釋100倍。用小聚丙烯試管進(jìn)行稀釋?zhuān)♂寱r(shí)至少需要4ul血清、陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。如：4ul血清加396ul稀釋液。
4）用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控各50ul加入到相應(yīng)的微孔中。注意，所有的樣品都必須用DENRA和NCA檢測(cè)。
5）用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。
注意：這樣是為了保證溫度的分布在每個(gè)孔的底部和邊緣同等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發(fā)，任何多余的封板膠必需被剪掉。
6）37℃下孵育1小時(shí)。注意：不要將微孔板疊放，必須單獨(dú)地分層平輔。這對(duì)于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體，不要讓板條接觸任何濕潤(rùn)的物質(zhì)，如濕紙巾等。
7）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。
9）用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。（同步驟5）
10）37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）
11）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
12）用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標(biāo)記的酶聯(lián)物。
13）用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。（同步驟5）
14）37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）
15）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
16）用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。
17）室溫下溫育（無(wú)需蓋板）5min。
18）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
19）用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。
20）室溫避光溫育10min。
21）溫育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液，室溫溫育1min。
22）溫育后，450nm處測(cè)OD值。