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禽腺病毒I群（FADV-I）PCR試劑盒常見問題及解決方案
禽腺病毒I群（FADV-I）PCR試劑盒常見問題及解決方案
一、檢測結果異常
1.無目標擴增或擴增效率低
●可能原因：
●核酸提取失敗（如樣本反復凍融超過5次導致DNA降解） 。
●試劑活性下降（未按-20℃保存或反復凍融超過5次）。
●PCR循環參數設置錯誤（如退火溫度未設為60℃）。
●解決方案：
●優化核酸提取步驟，推薦磁珠法或離心柱法，確保DNA純度。
●檢查試劑保存條件，避免不同批次試劑混用。
●核對儀器參數設置，確認擴增程序為“95℃預變性5分鐘，95℃ 15秒/60℃ 30秒，循環40次"。
2.非特異性擴增（假陽性）
●可能原因：
●樣本間交叉污染（如未使用濾芯吸頭或未區分實驗區域）。
●環境氣溶膠污染（實驗臺未徹-底消毒）。
●解決方案：
●使用無菌操作技術，嚴格劃分樣本處理區、試劑配制區和擴增區。
●實驗后用10%次氯酸或75%酒精消毒操作臺，廢液按生物危害物處理。
二、操作流程問題
1.樣本處理問題
●常見問題：
●活禽泄殖腔拭子未置于50%甘油生理鹽水中保存，導致核酸降解 。
●組織樣本未低溫運輸（推薦2-8℃冰袋保存），影響檢測準確性。
●解決方案：
●嚴格按規范保存樣本，活禽拭子需浸泡于50%甘油生理鹽水，組織樣本-20℃冷凍。
2.試劑配制誤差
●常見問題：
●預混液未完-全溶解或混勻，導致反應體系不均 。
●加樣體積偏差（如未按21μL預混液+4μL樣本比例配制。
●解決方案：
●使用前充分溶解試劑并短暫離心，避免氣泡干擾 。
●采用精準移液器（如低吸附吸頭）控制加樣量。
三、儀器與數據分析問題
1.擴增曲線異常
●可能原因：
●反應管密封不嚴導致蒸發（曲線呈鋸齒狀或不規則）。
●探針熒光衰減（未避光保存試劑或反復凍融） 。
●解決方案：
●檢查PCR管密封性，確保擴增過程無液體損失。
●試劑避光保存，開封后盡快使用。
2.結果判讀爭議
●常見問題：
●閾值線設置不當（需高于陰性對照熒光信號）。
●可疑樣本（Ct值35.0-38.0）未復測直接判讀。
●解決方案：
●調整基線參數（Start值3-15，Stop值5-20），手動設定閾值線。
●對可疑樣本重復檢測，若復測Ct值仍≤38.0則判為陽性。
四、質控標準與驗證
●質控失敗處理：
●陽性對照無擴增：檢查試劑活性或儀器校準（如FAM通道是否開啟）。
●陰性對照出現Ct值：排查環境污染或試劑污染，重新提取核酸。
五、其他注意事項
●試劑盒適用范圍：僅限科研使用，臨床診斷需結合其他檢測方法。
●冷鏈運輸要求：試劑需-20℃保存，運輸時使用冰袋（2-8℃）。
建議：若問題持續存在，可聯系供應商獲取技術支持。