實驗方法原理

利用重組技術將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離。

GST-pulldown主要包括以下三個部分：①利用基因重組技術構建帶有GST標簽的原核表達載體；②通過原核表達系統表達帶有GST標簽的融合蛋白；③利用GST親和純化柱進行蛋白純化獲得高純度的融合蛋白，再利用GST親和純化柱進行蛋白間的相互作用檢測。

實驗操作程序：

材料及試劑

探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細胞蛋白，或者組織蛋白提取物

細胞蛋白裂解液，洗脫液：PBS及PBS+1%Triton-100

（以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過表達蛋白B相互作用）

1：原核融合蛋白A的獲得

1.1：將編碼蛋白A與GST的重組質粒化轉BL21(DE3)菌株

1.2：挑取單個克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里，37℃培養過夜

1.3：將培養菌液轉移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當濃度的IPTG，在適當溫度下培養適當時間（誘導條件需要根據不同的蛋白做調整），6000g，10分鐘，4℃離心收集細菌，去盡上清，將菌體至于-20℃放置O/N

1.4：室溫凍融菌體，馬上置于冰上，每500ml培養液加入10-20ml細菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混勻

1.5：冰上超聲破碎，開2秒，停9秒，總40-60分鐘。至裂解液充分清涼

1.6：11000rpm，15分鐘，4℃離心分離上清， -80℃保存備用

2：真核融合蛋白B的獲得

2.1：將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達載體上，進行細胞轉染

3：48小時后，取適量融合蛋白GST-A 于冰上凍融

4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉結合1小時。

5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。

6：同時，裂解真核融合蛋白B，去盡培養基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鐘。

7：吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鐘，4℃離心取上清。

8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結合！4℃旋轉結合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。

10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鐘，高速離心，Run –SDS PAGE做Western Blot檢測。用HA或者myc Blot

注意事項：

內源性蛋白的干擾使得實驗出現的假陽性結果較多：

（1）高純度的GST融合蛋白能夠減少實驗的假陽性。由于高純度的融合蛋白能減少實驗結果的假陽性，因此獲得高純度的融合蛋白對于GST-pull down 實驗結果 分析具有重要的作用。同時，為了能夠盡可能的保證融合蛋白原有的生物學活性，一般在獲取融合蛋白時傾向于可溶性融合蛋白，因此獲得高純度的可溶性蛋白很關鍵。

（2）對于可溶性蛋白的獲得條件主要有①載體的選擇。②可溶性蛋白表達條件的選擇，③誘導溫度，④誘導時間，⑤誘導物的濃度，能夠不被細胞代謝而且具有穩定的濃度。