ABIPrism7000型熒光定量PCR儀快速入門指南

一.開機

1.確認電腦與主機的數據通訊線(灰色USB連線)連接正確。

2.確認電腦處于外接電源供電狀態。

3.啟動電腦,以Administrator用戶名登錄,進入Windows2000操作系統。

4.待桌面圖標出現后,打開7000主機的電源。

5.待主機的電源指示燈點亮后,啟動7000SDS應用軟件。

在進行實驗之前,請先檢查樣品加熱模塊以確定它沒有受到熒光污染,具體方法請按照第6節的“熒光污染的檢查與處理”流程進行。

二.實時定量的軟件運行

基因表達的定量和相對定量研究、轉基因食品的檢測(GMO)、各種病原體的檢驗檢疫等各種定量應用;以CT值的大小作為樣品陰性、陽性判定依據的定性應用;以及SNP檢測、等位基因鑒定實驗等的步PCR擴增,都是采用實時定量模式,按照以下步驟操作。

1.新建文件菜單File→New,Assay選擇AbsoluteQuantification(實時定量模式),打開一個空白的96孔板文件。

2.探針設置雙擊任意一個孔,打開WellInspector窗口，該窗口也可從菜單View→WellInspector打開。

3.使用軟件,或探針(Detector)沒有設置好,請點擊AddDetector按鈕,打開DetectorManager窗口。該窗口也可以從菜單Tools→DetectorManager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針,點擊按鈕File→New,新建探針:設定探針的名稱(建議使用所研究基因符號,如GAPDH、ACTIN等)、報告基團(FAM或者VIC)、淬滅基團(TaqMan探針選TAMRA;MGB探針選None)、顏色(任意)等。設置完成后點擊OK,該探針即出現在探針列表中。重復此過程,設立其他的探針。

4.在DetectorManager窗口,從探針列表中點擊選擇所需探針,按住Ctrl鍵可以選擇多個探針,再點擊AddtoPlateDocument按鈕。后點擊Done關閉DetectorManager窗口。此時WellInspector窗口仍然是打開的。

5.填樣品表在96孔表中選定有樣品的一個或多個孔,在WellInspector頁面的SampleName欄中填入樣品名稱;在探針列表的Use項下的方框中,打鉤選擇要用的一個或多個探針;在Task欄中選擇樣品類領:陰性對照選NTC;未知樣品選Unknown;標準品選Standard。對于Standard,還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數。注意:只有在這里輸入拷貝數后,軟件才能自動生成標準曲線。建議標準品的濃度在5點以上。建議每個樣品(包括標準品)都按照統計學要求作一定數量的復管。

6.參比熒光如果使用的是ABI公司的定量PCR試劑,如TaqManUniversalPCR

MasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix等,參比熒光(PassiveReference)選ROX;如果使用的試劑中不含有參比熒光,請選None。完成后點擊右上角的X按鈕,關閉WellInspector窗口。

7.循環參數切換到Instrument頁面,設定及修改PCR熱循環程序:在ABI公司默認的程序中,50°C2min是UNG酶起作用的步驟,UNG酶可以預防其他PCR擴增的產物(其中以U代替T)對定量PCR的污染;95°C10min的作用是激活Taq酶,同時滅活UNG酶;40個循環的95°C15sec和60°C1min是定量PCR的循環步驟。7000默認在后一步,也就是60°C1min復性和延伸時收集熒光信號。如果使用ABI公司的定量PCR試劑,上述參數不需要調整,直接運行PCR循環就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下,如果其中沒有UNG酶,請刪除50°C2min步驟;如果使用的不是Taq酶而是其他普通的Taq酶,請刪除95°C10min步驟。

8.循環參數的修改方法刪除:按住Shift鍵并在相應的Stage或Step中點擊,該步驟9.其他設置反應體積:定量PCR的標準反應體積是50μL;如果想修改的話,建被選中變黑,按Del鍵即可刪該步驟或循環。插入:在需要插入參數的位置點擊,出現粗黑豎線后,分別點擊AddHold、AddCycle或AddStep按鈕添加保溫、循環或循環中的一個步驟。修改溫度和時間:拖動鼠標,選中需要修改的溫度或時間數字,輸入新的數值即可。議大于25μL。融解曲線試驗:在DissociationProtocol選項左邊的方框中打鉤,儀器即在定量PCR循環完成后繼續做融解曲線試驗。如果是用SYBRGreenI染料方法進行定量研究,建議進行融解曲線試驗,以判定PCR反應特異與否。單峰表示單一的PCR擴增產物,多峰表示PCR擴增有雜帶。注意:只有SYBRGreenI染料方法才需要進行融解曲線試驗,TaqMan探針和MGB探針法都不需要。9600Emulation:選中此項,即可使7000的升降溫速度減慢,與9600和7700一樣,從而可以直接使用在9600、7700型PCR儀上優化好的循環條件,而不需任何修改。

10.啟動擴增點Save按鈕保存文件設置。確認96孔板或全部樣品管在主機內放置妥當后,點擊Start按鈕,開始PCR循環。屏幕上動態顯示PCR進程和剩余時間。

11.監控進程切換到Results頁面的AmpPlot子頁面,可以實時顯示PCR曲線隨著循環增加而逐步增長的實際情況。如果Detector選FAM或VIC,只顯示對應探針的變化情況;如果選All,則同時顯示所有探針的反應進程。

12.保存結果程序結束后,點Disconnect按鈕,然后File→Save保存實驗結果。可以保存為.sds格式,也可以保存為.sdt格式,作為以后同類實驗的模板,節省軟件設置時間。

三.實時定量的數據分析

1.數據分析切換到Result頁面,進入擴增曲線(AmplificationPlot)子頁面,查看軟件已經自動分析好的實驗結果。注意:此時的數據是軟件根據默認值(基線起點為3,終點為15)得到的初步結果,還需要根據本次實驗的具體情況,精細調節Baseline(基線)的起止點后,重新分析,以得到更的數據。

2.基線的起點和終點確定原則基線(Baseline)是指PCR開始時信號很低、接近背景且比較平穩的那個階段。起點要避開開始幾個循環由于高溫導致的信號增高,設在信號已經降到背景高度且能維持平穩的地方,一般在3到6個循環之間;終點要避免覆蓋信號已經開始有明顯增長的地方,一般在本組數據中小的CT值前再3個循環處。另外,起點與終點之間能間隔8個循環以上,以滿足統計基線標準偏差的數學要求。調整好起止點以后,再點擊Analyze按鈕,軟件即自動計算新的閾值和CT值,并更新實驗報告。注意:此時擴增曲線頁面上顯示的閾值數字并不更新,但是這不影響后臺數據運算的準確。

3.線性圖譜在默認的設置中,PCR擴增曲線圖譜的縱坐標代表經過ROX和空白校正后的相對熒光信號強度,橫坐標代表PCR循環次數(從1到40);縱坐標以對數表示,橫坐標以線性表示。如果要看*線性的S形圖譜,請雙擊縱坐標軸線,打開坐標設置窗口,將縱坐標改成線性形式。

4.原始數據切換到Component子頁面,察看原始數據。正常的FAM信號強度,基線時約為5000點,擴增完成達到約28000點,中間呈S形增長;TAMRA和ROX的信號開始時都比FAM的基線要稍低一點,TAMRA信號到指數增長階段會降低,而ROX信號是水平穩定的,不隨PCR進程而改變,因為ROX是以固定濃度加入到PCR試劑中的,它本身并不參與PCR擴增。

5.原始數據切換到Spectra子頁面,也可以察看原始數據。Spectra與Component這兩個頁面的區別是:Component顯示的是信號強度隨時間(即PCR循環次數)的變化,是縱向的;而Spectra顯示的是每個PCR循環點上信號強度在不同波長上的分布,也就是在4個濾色片上的分布,是橫向的。

6.標準曲線切換到StandardCurve子頁面,察看標準曲線。注意:只有在Setup時輸入標準品的拷貝數后,軟件才能自動生成標準曲線。

7.實驗報告切換到Report子頁面,察看實驗報告。確認無誤后,保存結果。也可以從File菜單中選擇Export,再選擇數據類型,輸出各種類型的數據,包括CT值、相對信號強度、原始數據、融解曲線數據和實驗結果等。輸出的數據可以用Excel打開,并可在Excel中重新生成擴增曲線、標準曲線等圖譜。

四.終點讀板的軟件運行

各種等位基因鑒定實驗,包括SNP檢測、基因突變檢測等,都包括兩個階段:1、PCR擴增;2、擴增后的熒光信號讀取(Post-read)和數據處理。步既可以在9700、9600等普通的PCR儀上進行,也可以在7000、7900等定量PCR儀上進行;第二步必須在定量PCR儀上進行。以下只敘述第二步Post-Read和數據處理的操作方法。如果步也在定量PCR儀上進行,請按第三節實時定量的實驗方法設置和運行軟件;待PCR完成、數據保存好后,再將同一塊板放在7000上,按以下步驟操作。

1.新建文件菜單File→New,Assay選擇AllelicDiscrimination(終點讀板模式,用于SNP分析等),新建一個空白96孔板文件。

2.探針設置雙擊任意一個孔,打開WellInspector窗口。該窗口也可以從菜單View→WellInspector打開。

3.使用軟件,或者Marker沒有設置好,先點擊AddDetector按鈕,打開DetectorManager窗口。該窗口也可以從菜單Tools→DetectorManager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針,File→New,新建探針,設定探針的名稱(建議使用等位基因的名稱,如Allele1、Allele2等)、報告基團(FAM或者VIC)、淬滅基團(TaqMan探針選TAMRA;MGB探針選None)、顏色(任意)等。設置完成后點擊OK,該探針即出現在探針列表中。

4.位點設置Detector設置好后,點擊AddMarker按鈕,打開MarkerManager窗口。該窗口也可以從菜單Tools→MarkerManager打開。如果在Marker列表中找不到合適的探針,點CreateMarker,取名(建議使用位點的名稱,如D2S1356等),OK,新位點的名字即出現在左邊的位點列表中,選中位點,在右邊的探針列表中打鉤選擇與該位點配套的探針,一般FAM、VIC各一個組成一套。

5.選擇位點Marker設置完成后,在左邊的位點列表中選中該Marker,點擊CopytoPlateDocument按鈕,該Marker的信息即分成3行出現在WellInspector窗口中。重復選好全部所需Marker,再點擊Done關閉MarkerManager窗口。注意:定量PCR實驗只要求設置探針(Detector)即可,而SNP實驗既要設置探針(Detector),還要設置位點(Marker)。如果沒有設置Marker,軟件將不能進行基因分型。

6.填樣品表在96孔表中選定有同類樣品的一個或多個孔,在WellInspector頁面asterctor窗口。的Marker列表的Use項下的方框中打鉤,選擇要用的Marker,然后在探針的Task欄選擇樣品類型:陰性對照選NTC;未知樣品選Unknown。沒有Std。

7.參比熒光如果用的是ABI公司的PCR試劑,如TaqManUniversalPCRMMixwithorwithoutUNG,參比熒光(PassiveReference)選ROX;如果所用試劑中不含ROX參比熒光,請選None。點擊右上角的X按鈕關閉WellInspe。

8.循環參數切換到Instrument頁面。PCR熱循環程序只有60°C一個步驟,不需要修改。設置反應體積。SNP的標準反應體積是50μL。點Save按鈕保存文件設置。

9.終點讀板確認96孔板或全部樣品管在主機內放置妥當后,點擊Post-read按鈕,nect按鈕,然后File→Save保存實驗結果。

10.保存結果程序結束后點Discon

五.終點讀板的數據分析

Allelicdiscrimination子頁面,在Marker下拉菜單X軸的是VIC信號,中選面看實驗報告。確認無誤后,保存分析結果。也可以開始讀取數據,大約10秒完成。

1.數據分析切換到Results頁面中選擇要查看其數據的Marker,在下面96孔板界面中按Excel方式選擇需要查看的樣品孔,軟件即在中間的圖譜上顯示信號的分布情況。選擇不同的Marker,顯示不同的信號?？梢渣c擊放大或縮小工具調整圖譜的大小。

2.信號分布正常的信號應該分為4組,靠近原點處為NTC;靠近是純合子,其正常信號強度范圍在2-8之間;靠近Y軸的是FAM信號,是另一種純合子,其正常信號強度范圍在4-16之間;靠近對角線位置的樣品中既有FAM信號也有VIC信號,是雜合子,強度為FAM和VIC各自的一半左右。

3.基因分型點擊套索工具,然后通過鼠標圈定NTC信號,在Call下拉菜單NTC,這些數據點即被分型為NTC并顯示相應的顏色和圖標;同樣分型FAM純合子、VIC純合子和雜合子。

4.保存結果切換到Report頁從File菜單中選擇Export,再選擇數據類型,輸出各種類型的數據。

六.日常維護

1.熒光污染的檢查與處理新建一個空的96孔板,菜單Instrument→Calibrate打開ROIInspector窗口,將ExposureTime調到4096,選定FilterB,點擊Snapshot按鈕(不要動下面兩個按鈕,以免ROI設置出錯),此時可以看到排列整齊的96孔圖像。如果觀察到特別明亮的光斑,則表明該孔存在熒光污染。將光標移動到單個孔的上方可在右側欄中的PixelIntensity處讀出該孔的熒光信號值,超過500以上的需要清洗。清洗時盡量使用較細且無硬物突出的干棉簽擦拭;如果未能去除,可用去離子水清洗;如污垢頑固,可使用90%乙醇清洗,但要等乙醇*揮發干凈后方可蓋上熱蓋,以免有機溶劑損傷熱蓋上的透鏡組。

2.檢測器光源的更換流程關機冷卻約15分鐘后,打開儀器頂部蓋板,擰松燈泡保護罩的螺釘,取下保護罩,將燈泡拆下,更換新的燈泡并插好連線。注意:備用的新燈泡必須保存在干燥環境中。