hESC（H9）人胚胎干細胞生長記錄
| 一、細胞基本屬性 | ||||
| 細胞名稱 | hESC（H9）人胚胎干細胞 | |||
| 細胞別稱 | hESC；H9；人胚胎干細胞 | |||
| 種屬來源 | 人 | |||
| 組織來源 | 人胚胎干細胞 | |||
| 生長特性 | 貼壁生長 | |||
| 細胞形態(tài) | 克隆狀細胞樣 | |||
| 背景簡介 | hESC（H9）細胞株來源于人胚胎干細胞，貼壁生長，呈克隆狀，可在hESC/iPSC培養(yǎng)基中快速增殖，而邊緣分化的細胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢，從而選擇性擴增并獲得高純度人多能干細胞。包裝規(guī)格為1mL凍存管，含量為>1x106個/mL，且支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性。人胚胎干細胞H9，曾用名WA09。每支細胞可復(fù)蘇至一個T25，3至4天后會形成30至40個克隆。 | |||
| STR位點 | D5S818: 11,12；D13S317: 9；D7S820: 9,11；D16S539: 12,13；vWA: 17；THO1: 9；Amelogenin: X；TPOX: 10,11；CSF1PO: 11。 | |||
| 細胞熒光檢測 |
人胚胎干細胞H9培養(yǎng)鑒定實驗報告下載 | |||
| 細胞代數(shù) | 10代以內(nèi) | |||
| 細胞規(guī)格 | 1x106cells/T25或1mL凍存管 | |||
| 支原體檢測 | 無 | |||
| 保藏機構(gòu) | 分子細胞科學(xué)創(chuàng)新中心 | |||
| 培養(yǎng)基 | hESC/iPSC細胞培養(yǎng)試劑盒 | |||
| 培養(yǎng)條件 | 氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃ | |||
| 凍存條件 | 無血清凍存液，液氮儲存 | |||
| 細胞貨期 | 現(xiàn)貨，1周左右 | |||
| 運輸方式 | 復(fù)蘇發(fā)貨（T25瓶免運輸費用）/ 凍存發(fā)貨（需加干冰運輸費用） 順豐快遞 | |||
| 特別說明 | 以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主 | |||
| 二、細胞培養(yǎng)操作 | ||||
| 試劑準(zhǔn)備 | 1）hESC/iPSC培養(yǎng)基配制（500 mL） 1.在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。 2. 參考表1在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC培養(yǎng)基，之后置于4℃儲存，封口膜封好后2周內(nèi)使用。 3. 有初培養(yǎng)需擴建的需求，建議先配置100 mL，保證2周內(nèi)使用完畢。
A. 分裝 Matrigel 1.貨號354277的Matrigel，操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。 2. 準(zhǔn)備18個無菌1.5 mL EP管，標(biāo)記Matrigel日期、操作人；1mL無菌吸頭；EP管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時。 3. 將Matrigel放置4℃冰箱過夜解凍，當(dāng)Matrigel解凍即可開始分裝。 注：在解凍時，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。 4.準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。 5.混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時需要更換吸頭。 6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。 B.鋪板 1.取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準(zhǔn)備4個6孔板，標(biāo)記Matrigel、批號、日期和操作人。 2.1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時，取出一支冷凍的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解凍至化凍。 3.準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。 4.用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。 5.吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。 6.分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。 7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用，或置于4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。 | |||
| 復(fù)蘇方法 | 1）復(fù)蘇hESC/iPSC（以6孔板為例） 1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫（15~30℃）。 2. 取4 mL hESC/iPSC培養(yǎng)基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫（15~30℃）。 注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。 3. 取出1支冷凍的細胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將消失時取出。 4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。 5. 吸棄上清，加入預(yù)溫的4 mL的hESC/iPSC培養(yǎng)基+hESC/iPSC Supplement C制備細胞懸液，盡量避免吹打。 注：可留20 μL上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。 6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，將細胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中。 7. 水平十字搖勻三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。 8. 18-24小時后換新的hESC/iPSC培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。 注：在hESC(H1)培養(yǎng)過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。
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| 傳代方法 | 傳代hESC/iPSC（以6孔板為例） 1. 傳代條件：① 細胞匯合度達85%左右（如圖1(C-D)所示），一般情況下每3-4天傳代； ② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。 注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。 2.傳代比例：可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻（如圖1(C-D)所示），建議按照1:8進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。 注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔（以6孔板為例）。 3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫（~25℃）。 4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫（~25℃）。 5. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫（~25℃）。 6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫（~25℃）。 7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸取。 8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液覆蓋孔底。 9. 置于37℃培養(yǎng)箱中孵育8-9 min。 注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細胞變化，當(dāng)大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間； ② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。
11. 及時加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃6孔板使細胞脫離基質(zhì)。 注：① 加hESC/iPSC培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細胞1-2次，不能超過2次，避免反復(fù)吹打；有部分細胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間（< 10min）。
12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。 13. 在6孔板上標(biāo)記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。 注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟9獲得的細胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細胞1-2次；再按照傳代比例接種。 14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。 15. 18-24小時后更換新hESC/iPSC培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。 | |||
| 注意事項 | 1.運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。 2.因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。 | 1.收貨時若發(fā)現(xiàn)干冰化完，檢查凍存管是否融化，若已融化需直接離心細胞接種觀察，若未融化可以將細胞按正常步驟保存； 2.為保證細胞的高存活率，收到產(chǎn)品后，請立即解凍復(fù)蘇細胞。 | ||
| 到貨須知 | 1.收到細胞后，及時拍照記錄有無漏液、渾濁或瓶身破損現(xiàn)象。 2.靜置完成后，取出細胞培養(yǎng)瓶，鏡檢、拍照（當(dāng)天以及第 2,3 天請拍照），記錄細胞狀態(tài) (所拍照片將作為后續(xù)服務(wù)依據(jù))；建議細胞傳代培養(yǎng)后，定期拍照、記錄細胞生長狀態(tài)。 3.由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。 4. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。 | |||
| 備注：客戶在細胞培養(yǎng)過程中，有任何技術(shù)問題可以技術(shù)服務(wù)電話： 按 2，我們隨時給予解答。 | ||||
| 三、細胞凍存操作 | ||||
| 凍存液配方 | 無血清凍存液，液氮儲存 | |||
| 細胞密度 | 待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例 | |||
| 凍存方法 | 3）凍存hESC/iPSC（以6孔板為例） 1. 當(dāng)細胞匯合度達85%左右（如圖1(C-D)所示）可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。 2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標(biāo)記細胞名稱、代次（P#）、日期、操作人。 3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。 4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。 5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計時8-9 min（可參考“六、傳代hESC/iPSC"步驟）。 6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。 7. 搖勻預(yù)溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中。 8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。 | |||
| 注意事項 | 凍存細胞轉(zhuǎn)入液氮后及時復(fù)蘇一管檢查細胞凍存活性，若有異常，及時調(diào)整實驗方案 | |||
| 四、售后服務(wù) | ||||
| 重發(fā)標(biāo)準(zhǔn) | 1.細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等，重發(fā)； 2.收到細胞未開封，如出現(xiàn)污染狀況，重發(fā)； 3.收到細胞3天內(nèi)，發(fā)現(xiàn)污染問題，經(jīng)核實后，重發(fā)； 4.常溫發(fā)貨的細胞靜置 2 小時后，干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇 2 天后，絕大多數(shù)細胞未存活，經(jīng)核實后，重發(fā)； 5.常溫發(fā)貨的細胞靜置 22 小時并且未開封或干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇 2 天后，出現(xiàn)污染，經(jīng)核實后，重發(fā)； 6.細胞活性問題，請在收到產(chǎn)品 3 天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力，經(jīng)核實后，重發(fā)； 7.視具體情況而定。 | |||
| 不予重發(fā) | 1.客戶操作造成細胞污染，不重發(fā)； 2.客戶嚴(yán)重操作失誤致細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)； 3.非我們推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)； 4.細胞狀態(tài)不好，未提供真實清晰的培養(yǎng)前 3 天的細胞狀態(tài)照片，不重發(fā)； 5.細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題的，不重發(fā)； 6.收到細胞發(fā)現(xiàn)問題與客服人員溝通的時間證明大于3天的，不重發(fā)； 7.視具體情況而定。 | |||
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