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WB實驗流程
閱讀：1275 發布時間：2024-8-12WB實驗流程
WB實驗，即Western Blot實驗，也被稱為蛋白質印跡或免疫印跡，是一種基于抗原抗體特異性結合原理的綜合性免疫學檢測技術。該技術主要用于檢測細胞或組織提取物中的蛋白表達水平，并廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測等多個方面。
以下是WB實驗的詳細流程：
一、實驗前準備
明確目的蛋白：了解所研究的目的蛋白在待測樣本中的表達情況、蛋白大小、翻譯后修飾等信息。
選擇樣本：根據實驗目的選擇合適的細胞或組織樣本，并參考相關文獻或數據庫（如UniProt、NCBI、BIOGPS等）獲取樣本信息。
試劑準備：配置實驗所需的各種試劑，如電泳緩沖液、轉膜緩沖液、TBS、封閉液、抗體稀釋液等。
二、實驗流程
1. 樣本制備
樣本獲取：從細胞或組織中獲取樣本。
蛋白裂解：使用適當的裂解液（如RIPA裂解液）裂解樣本，釋放蛋白質。注意在冰上操作以減少蛋白降解，對于磷酸化蛋白檢測，需加入磷酸酶抑制劑混合物。
蛋白定量：使用BCA法等方法對提取的蛋白進行定量，確保上樣時各泳道的蛋白量一致。
蛋白變性：加入蛋白上樣緩沖液，并通過加熱使蛋白變性，形成線性結構，便于電泳和抗體結合。
2. SDS-PAGE電泳
制膠：根據目標蛋白的分子量大小選擇合適的分離膠和濃縮膠濃度。
上樣：將變性后的蛋白樣品加入凝膠上樣孔中，同時加入預染的蛋白分子量標準（Marker）作為參照。
電泳：在適當的電壓下進行電泳，使蛋白根據分子量大小在凝膠中分離。
3. 轉膜
選擇轉膜膜：常用的轉膜膜有NC膜和PVDF膜，根據實驗需求選擇合適的膜。
轉膜操作：采用濕轉或半干轉等方法將凝膠上的蛋白轉移到膜上。注意保持膜的濕潤和避免氣泡產生。
4. 封閉
封閉液選擇：常用5%脫脂奶粉或BSA作為封閉液。
封閉操作：將膜放入封閉液中室溫封閉一定時間（如1小時），以封閉膜上的非特異性結合位點。
5. 抗體孵育
一抗孵育：將膜放入稀釋好的一抗溶液中，在適當的條件下（如4℃搖床過夜）孵育，使一抗與目的蛋白特異性結合。
洗膜：用TBST等洗脫液洗去未結合的一抗。
二抗孵育：將膜放入稀釋好的二抗溶液中孵育一定時間（如室溫1小時），使二抗與一抗結合。同樣需要洗膜去除未結合的二抗。
6. 化學發光與顯影
化學發光：將膜放入含有化學發光底物的溶液中孵育一定時間，使目的蛋白所在位置產生熒光。
顯影：使用化學發光成像系統對膜進行曝光和拍照，記錄實驗結果。
三、注意事項
實驗過程中需嚴格控制實驗條件，如溫度、時間、電壓等，以確保實驗結果的準確性。
注意避免蛋白降解和非特異性結合的產生，以提高實驗的特異性和靈敏度。
在使用抗體時需參照抗體說明書進行操作，確保抗體的稀釋比例和孵育條件正確無誤。
通過以上流程，WB實驗可以實現對細胞或組織提取物中特定蛋白的檢測和分析，為科學研究提供有力支持。