化工儀器網
技術文章
利用塞曼石墨爐原子吸收光譜測量血清中的硒
閱讀：843 發布時間：2022-1-20前言：由于母嬰飲食中硒的缺乏，導致一些新生兒血清樣品中的硒含量僅處 于 20 µg/L 的痕量水平 [9]。 此前業內已發表了大量有關通過 GFAAS 測定血液和血清中的硒的分 析方法 [1,5,6,7,9]。本研究介紹了新儀器和程序的應用，這對于獲得最 高準確度和精密度非常重要。
硒的測定面臨著諸多困難：
• 196.0 nm 的共振波長處于遠 UV 區，樣品中可能存在的有機化合物 和無機化合物在該波長下均會產生分子吸收。這一問題可通過塞 曼背景校正加以解決 利用塞曼石墨爐原子吸收光譜測量血 清中的硒 應用簡報 作者 John Sanders 安捷倫科技公司 澳大利亞墨爾本 臨床研究 2
• 傳統空心陰極燈在該波長下的強度導致精密度 有限 [6]。而增強放電空心陰極燈可提高光源的 強度，從而降低噪音水平。此外，選擇特殊的 光電倍增管有助于在該光譜區提供優異的響應
• 在血清這種復雜的樣品基質中，硒可能存在于 各種化學物質中的任何一種中，這會導致石墨 爐的原子化器產生原子化問題。采用化學改性 劑能夠解決這一問題
• 硒的揮發性非常強，可能在灰化階段產生損 失。必須使用合適的改性劑與硒形成化合物， 以使分析物在原子化之前能夠在較高的灰化溫 度下盡可能多地除去基質
實驗部分 儀器 本研究使用 Agilent SpectrAA-880 塞曼石墨爐原子吸收光譜儀和可編程進樣器。 該儀器配備了 R166UH 光電倍增管，并在 15 mA 陰 極電流和 20 mA 增強電流下操作 Se 增強放電空心 陰極燈。 所需試劑 10% 的消泡劑 B 乳濁液 (Sigma Chemical)。重要的 是，消泡劑應為具有純白色乳狀外觀的穩定的不分 散乳液。而來自其他供應商的消泡劑產品批次出現 了分離現象；這種分離的材料不能滿足要求。 Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 (BDH) 硒標準品 1000 mg/L Mallinckrodt AA 標準品 Seronorm 標準品 Nycomed Pharma AS Norway 批次號 010017血清對照樣品 UTAK 痕量元素對照樣品，正常 濃度，批號 7772 L-抗壞血酸 BDH AnalaR 級 氯化鈀 1000 mg/L Mallinckrodt AA 標準 品，PdCl2
試劑制備：樣品稀釋劑 0.056% wt/vol 抗壞血酸 0.088% vol/vol Triton X-100 0.1% vol/vol 消泡劑“B" 配制樣品稀釋劑：將 0.56 g 抗壞血酸、0.88 mL Triton X-100 和 1 mL 消泡劑 B 溶于少量去離子水中，加入 0.1 mL 鹽酸并將溶液稀釋至 1.0 L。 加入鹽酸以降低溶液的 pH，并確保在稀釋劑與血 清樣品混合時獲得澄清溶液。盡管該溶液可保持 穩定長達 2 天時間，還是建議使用當天配制的新鮮 溶液。 自動進樣器清洗 0.05% Triton X-100，0.1% 消泡劑 B 移取 0.5 mL Triton X-100 和 1.0 mL 消泡劑 B 至 1 L 標 準燒瓶中，用去離子水稀釋至 1.0 L。 改性劑 500 mg/L 鈀，0.05% Triton X-100，0.1% 消泡劑 B： 移取 10 mL 1000 mg/L 的鈀標準品和 2 mL 濃鹽酸至 20 mL 標準燒瓶中。加入 100 µL Triton X-100 和 20 µL 消泡劑 B，并用去離子水稀釋至 20 mL。 標樣 標樣原液 1.00 mg/L 3 通過使用蒸餾-去離子水將 10.00 mL 的 1000 mg/L 標 準品稀釋至 1 L 來配制 10 mg/L 的標樣，然后通過 使用樣品稀釋劑將 10.00 mL 10 mg/L 的標樣稀釋至 100 mL 來配制 1.00 mg/L 標樣。
工作標樣 依據表 1 所列的比例，分別將不同量的由樣品稀釋 劑配制而成的標樣添加至每份 Seronorm 標準品中 配制工作標樣。 所有溶液均在標準燒瓶中稀釋至最終體積為 10 mL。 在配制溶液過程中，將 Seronorm 標準品添加至 10 mL 干燥的燒瓶中，然后加入 1 mg/L 的標樣。靜置約 一小時，然后用樣品稀釋劑稀釋至最終體積。
自動進樣器準備 將自動進樣器清洗瓶注滿 Triton X-100/消泡劑 B 清洗 液，按照操作手冊中推薦的方法對系統進行吹掃。 樣品毛細管的必須保持嚴格清潔，并且應在每 次自動運行開始時用王水進行清洗。該清洗過程最 好通過以下方式進行：將酸注滿樣品瓶并手動將自動進樣器探頭的浸至酸 中。然后使用進樣注射器將酸吸入毛細管中，確保 所有殘留物和污染物均被移除。采用注射器將酸推入并吸出毛細管，使酸與毛細管 接觸 2–3 min。 最后使用 Rinse（清洗）命令除去酸并清洗毛細管 兩到三次。
樣品前處理 注意：所有樣品都應視為潛在的生物危害物，在樣 品處理中必須遵守當地衛生管理局所要求的全部安 全預防措施。 用樣品稀釋劑按 1:10 的比例稀釋樣品（在樣品體 積有限的情況下，可在微量水平進行）：用 90.0 µL 樣品稀釋劑稀釋 10.0 µL 樣品，并將其直接放入樣 品杯中。 為保持樣品與標樣添加組中的改性劑濃度與添加劑 相同，不得用蒸餾水稀釋樣品。 分析 采用 SpectrAA-800 標簽文件創建樣品列表以進行樣 品識別。該列表可直接從其他數據文件（如逗號分 隔的文件）中導入。所示的方法采用添加預混合標 樣的方式，目的是獲得準確一致的報告結果。由于 樣品的復雜性，需要使用預混合的標樣。 設置表 2 中所列出的操作條件并啟動序列操作。 利用 SpectrAA-800 軟件中所包含的 QC 方案，該系 統可通過自動重新校準或發出可疑結果警告來監視 對照樣品的性能和儀器性能。
校準曲線在吸光度 0.3 以上基本呈線性，如圖 1 所 示。校準曲線的回歸方程為： ABS = 0.00082786*Conc + 0.00000003*Conc [2]。 這說明能夠放心地在更廣泛的分析范圍內采用標樣 添加技術及其應用。
對石墨管進行老化處理十分必要，需要使用樣品或 空白對石墨管進行 6 至 9 次空燒，從而在管內形成 涂層。一旦形成，則不得破壞該涂層。避免使用管 線清洗功能去除殘留物。經試驗發現，該方法能夠 分析 40–80 個樣品且不受血清灰分殘留的干擾。使 用管線清洗功能將導致石墨管的壽命大大縮短且精 密度下降。
使用鈀作為改性劑十分方便和有效 [4,5,8]。盡管在 Se 測定中也推薦使用其他改性劑，例如鎳，但是 使用鎳會導致石墨爐中的鎳殘留量較高。如果用戶 隨后希望分析痕量的鎳，這將會帶來麻煩。 儀器基線噪音水平會限制分析的精密度。研究發 現，有兩種可用途徑能夠減小該噪音源。 首先，使用增強放大空心陰極燈提高燈的光輸出。 其次，利用特殊的 UV 敏感型光電倍增管（如 Hamamatsu R166UH）也可獲得更高的增益，相比 于普通 R446，該光電倍增管在低 UV 區的輻照靈敏 度提高了將近六倍。R166UH 光電倍增管的另一項 優勢在于其在可見光區具有極小的響應，因此在 使用 2500 °C 以上的原子化溫度時，不易受到散射 石墨爐輻射所形成的噪音的影響。圖 3 和 4 對使 用不同光源和檢測器獲得的信號進行了比較。使 用 R166UH 和增強放電空心陰極燈獲得的改善非常 明顯，并體現在分析的精密度中。此外，使用增強 放電空心陰極燈和 R166UH 光電倍增管還可降低檢 測限。
將增強放電空心陰極燈用于硒的測定的另一項優勢 在于靈敏度提高，這是由于同傳統的空心陰極燈相 比，其在 196.0 nm 共振譜線處的信噪比得以提高。 硒的形態分析是石墨爐原子化的一個已知問題，如 Jacobson 和 Lockitch [9] 以及 Johannessen 等人 [4] 所述。這使對于通過各種技術獲得的結果的總體有 效性產生了一些擔憂。在此背景下，本分析采用峰面積而非峰高可能更為有利。SpectrAA-800 特別適 用于本項工作，在分析低吸光度水平的樣品時，可 獲得足夠高的數值分辨率，例如小數點后四位數， 并且能夠同時記錄峰高和峰面積結果。此外，還能 夠查看每次空燒的曲線，從而在確定最終結果時可 以將那些表現出假峰或異常峰形的譜峰排除。表 3 數據在不同日期內獲得，表明對于 UTAK 對照樣品 （批號 7772），通過峰面積和峰高均獲得了出色的 分析結果。
利用石墨爐 PROMT 測量模式還可以提高分析速 度。在該模式下，用戶可定義所需的精密度和最多 重復測定次數。一旦獲得期望的精密度，系統將自 動轉到下一個樣品。與此同時，自動進樣器在當 前樣品原子化的過程中準備下一次進樣的溶液。 相比于傳統儀器，每個溶液的分析速度可節省約 30 秒，獲得具有已知精密度的結果，能夠節省大 量時間。 血清的復雜性導致蛋白質和脂肪物質積累在樣品 探頭中和樣品探頭周圍。采用包含乳化硅油的消泡 劑 B 可以在探頭的潤濕表面上形成一層薄的硅油涂 層，使其具有疏水性并確保表面清潔。這樣可避免 交叉污染并提高重現性。 消泡劑 B 還使改性劑和樣品均勻分散于石墨管中， 可在關鍵的干燥和灰化階段中減少起泡。
結論 本文所述的程序為分析血清中的硒提供了一種 可靠的分析方法，濃度 100 µg/L 下的變異系數優 于 5%。