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ELISA免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測抗體或者抗原進(jìn)行分析測定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。

操作步驟:免疫識(shí)別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識(shí)別待測的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識(shí)別信號(hào)。最后利用信號(hào)強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計(jì)算得出待測樣中目標(biāo)抗原的濃度。

操作要點(diǎn)：

1、標(biāo)本

對(duì)于血清標(biāo)本，采集血液時(shí)需注意溶血。此外，為避免細(xì)胞裂解釋放出目標(biāo)檢測分子影響實(shí)驗(yàn)，檢測物宜進(jìn)行離心去除細(xì)胞成份。

2、加樣

注意將所加物加至板孔底部，避免加在孔壁上部，不可濺出或產(chǎn)生氣泡。加不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)更換槍頭，以免發(fā)生交叉污染。另外在顯色時(shí)，最好使用排槍迅速完成加液過程，以減少反應(yīng)時(shí)間不一致引起的孔間差異。

3、稀釋

在稀釋過程中,要注意使用同一微量加樣器、同一類槍頭和容器,保證所稀釋液體容量一致。

4、孵育

37℃恒溫箱孵育時(shí)，酶標(biāo)板應(yīng)放在濕盒內(nèi),濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,在盒底墊濕的紗布,最后將酶標(biāo)板放在濕紗布上，并且酶標(biāo)板不能疊放,以保證各板的溫度能迅速平衡。孵育時(shí)間一般為1～1.5h，不宜過長。如采用4℃孵育,則應(yīng)將酶標(biāo)板包好,以免試劑與外界反應(yīng)或蒸發(fā)。

5、洗滌

應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,保證洗滌液注滿各孔,洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干,并應(yīng)嚴(yán)格遵守洗滌時(shí)間,不得馬虎。

6、顯色

顯色液量不可過多，加樣的工作環(huán)境不能處于陽光直射的環(huán)境下，加顯色系統(tǒng)后要避光反應(yīng)，顯色液量不能過多，以免顯色過強(qiáng)。

7、讀板

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干酶標(biāo)板底附著的液體,以減少比色受干擾,然后

將板正確放入酶標(biāo)儀的比色架中。酶標(biāo)儀應(yīng)安置在避光環(huán)境下,操作室溫宜在15～30℃,在使用前應(yīng)先預(yù)熱酶標(biāo)儀15-30分鐘,這樣測定結(jié)果更加穩(wěn)定。