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技術(shù)文章

?PCR實驗過程中需要注意的問題

閱讀:2273          發(fā)布時間:2021-10-8

1、如何確定引物的濃度?

前面我們說到,引物一般交由試劑公司合成,有時候具體的濃度我們也不能確定。有些人喜歡稀釋十倍,有些人喜歡稀釋二十倍。我個人認為比較穩(wěn)妥的做法是在每次拿到反轉(zhuǎn)的 cDNA 后,先會稀釋 3 倍左右,然后利用管家基因做一次 RT-PCR,循環(huán)數(shù)一般為 25 循環(huán),鑒定一下具體濃度,再決定最后的稀釋倍數(shù)。


2、合成的引物是我們想要的引物嗎?

一般來說在拿到很多引物的時候,可以通過普通的 PCR 看看是否是單一條帶,鑒定一下引物的特異性。如果實驗室不差錢,則可以通過溶解曲線對所有的引物的特異性做一次鑒定。


3、操作過程中需要注意哪些問題?

一定要戴手套,戴手套,戴手套,重要的事情說三遍。根據(jù)經(jīng)驗,少量模板的加入,容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差,我們一般會將樣本再稀釋一倍,加樣的時候多加一倍,減少 H2O  的加入量。


4、你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎?

你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器,那么你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板。因為不兼容的 PCR 板會導(dǎo)致結(jié)果偏差。這種狀況實驗小白尤其需要注意。



5、凝膠放入電泳槽有什么注意事項嗎?

凝膠放入電泳槽時一定要注意方向,核酸是帶負電的,所以電泳的方向是從負極向正極跑,因此,加樣孔一定要對著負極放置,不然樣本就跑到膠外面去了。


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