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小鼠滑膜成纖維細胞

一、細胞基本屬性

 

培養基：MCM基礎培養基：，FBS，Penicillin，Streptomycin等

包被條件：-

傳代特性：可傳3-5代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞簡介：小鼠滑膜細胞分離自滑膜組織；滑膜是關節囊的內層，淡紅色，平滑閃光，薄而柔潤，由疏松結締組織組成。關節腔內的所有結構，除關節軟骨、半月軟骨板以外,即便是通過關節腔的肌腱、韌帶等均全部為滑膜所包裹。滑膜分泌滑液，在關節活動中起重要作用；正常滑膜分為兩層，即薄的細胞層(內腔層)和血管層(內膜下層)，是血管豐富的關節囊內膜，貼附于非關節面部分，覆蓋于關節囊內的骨面上，不在軟骨面上，此部分稱為邊緣區或“裸區"。滑膜呈粉紅色，光滑發亮、濕而潤滑，有時可見絨毛，內含膠原性纖維。 滑膜細胞有A、B兩型。巨噬細胞樣A型細胞表面有絲狀偽足+漿膜內陷、囊泡、線粒體、溶酶體、胞漿纖維和高爾基體，具有吞噬功能；B型細胞缺少此種特征，但含有高濃度的內質網，具有合成包括酶在內的蛋白質。其功能是分泌透明質酸，內膜下層含有泡沫組織，有脂肪細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和巨大細胞，與滑膜平行的有彈性纖維，能防止滑膜的皺襞形成。滑膜細胞主要功能：（1）滑膜細胞產生潤滑液成分，并且與關節腔的吸收和血液/潤滑液交換有關。（2）滑膜細胞增生，表現為不依賴于支持物生長，并且分泌大量的效應分子來促進炎癥和關節損壞。（3）是自身自分泌和旁分泌網絡中效應因子的一部分。
原代細胞分離培養的思路：

取材--分離--培養--鑒定

首先將組織從機體中取出，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養基中培養，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。

五、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置于37℃、5％CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含素的混合培養基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和技術部溝通；由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯系，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。
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