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    實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學技術。該方法利用熒光染料或探針，當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結合時會發出信號，從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應用。

RT-qPCR原理的三個主要步驟：

1 、反轉錄：

1）、使用逆轉錄酶和特定引物將RNA樣品反轉錄成cDNA。

2）、該步驟將RNA模板轉化為更穩定且可擴增的DNA形式。

3）、反轉錄過程中使用特定引物。

2 、PCR擴增：

1）、使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環繞目標區域。

2）、PCR是一個循環過程，呈指數級擴增DNA模板的數量。

3）、PCR反應中包含熒光染料或探針，它們結合到擴增的DNA序列上并發出熒光信號。

3、 熒光實時檢測：

1）、使用實時PCR儀器實時監測熒光信號。

2）、熒光的數量與每個PCR循環中擴增的DNA數量成比例。

3）、使用專業軟件分析數據以確定循環閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環數。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。

根據所使用的技術不同，實時熒光定量PCR可以分為：熒光探針和熒光染料兩種方法。

現將其原理簡述如下：

 1. TaqMan熒光探針

    TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的shou選技術平臺。

2. SYBR熒光染料

    在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過程是：

    ① 開始反應，當SYBR染料與DNA雙鏈結合時發出熒光；

    ② DNA變性時，SYBR染料釋放出來，熒光急劇減少；

    ③ 在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR引物；

    ④ 聚合完成后，SYBR染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。

    實時熒光定量PCR技術根據化學原理可以分為探針類和非探針類。探針類實時熒光定量 PCR 技術主要是利用與靶序列特異雜 交的探針來指示擴增產物的增加；非探針類實時熒光定量 PCR 技 術主要通過熒光染料來指示產物的增加。無論是探針類實時熒光 定量 PCR 技術還是非探針類實時熒光定量 PCR 技術，檢測的都是 擴增產物的增加量。但探針類實時熒光定量 PCR 技術增加了識別 探針的具體的流程，操作的難度較大。