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影響PCR反應(yīng)結(jié)果的各組分綜述
閱讀：906 發(fā)布時間：2023-6-27 PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。
1． 反應(yīng)緩沖液：
一般隨Taq DNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200μM時，Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進行反應(yīng)時，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗，一般以1.5-2mM（終濃度）較好。
2． dNTP ：
高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。
3． Taq DNA聚合酶酶：
在100μl反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對PCR反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降低。
4． 引物：
引物是決定 PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在 PCR 反應(yīng)中極為重要。要保證 PCR
反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板 DNA 進行擴增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：
⑴ 引物的長度以 15-30bp 為宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃
［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應(yīng)盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出
是隨機的。
⑵ 引物的 3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在 3’端
不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸
效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于 5 個，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不
能超過 3 個由于影響引物設(shè)計的因素比較多，現(xiàn)常常利用計算機輔助設(shè)計。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng) PAGE 或離子交換 HPLC 進行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），
二是當(dāng)擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低
濃度引物不僅經(jīng)濟，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用 0.25-0.5pM/μl 較好。
⑸ 引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液（約 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中
一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。
5． 模板：
PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用μg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。
6． PCR循環(huán)加快，即相對減少變性、復(fù)性、延伸的時間，可增加產(chǎn)物的特異性。