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RT-PCR引物的設計原則把握
閱讀：500 發布時間：2023-4-231、引物的特異性決定PCR反應特異性。因此引物設計是否合理對于整個實驗有著至關重要的影響。在引物設計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內含子。
2、引物設計原則的把握包括:
1、.引物長度:一般為15～30 bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應的特異性。
2、.堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續出現3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴增的復性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。
3、3‘端要求：3’端必須與模板嚴格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。末位堿基是A時錯配的引發效率zui低，G、C居中間，因此引物的3’端最好選用A、G、C而盡可能避免連續出現兩個以上的T。
4、引物自身二級結構：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發夾狀結構或引物自身復性。
5、引物之間的二級結構：兩引物之間不應有多于4個連續堿基互補，3’端不應超過2個。
6、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續8個的互補堿基存在。
g.5’端無嚴格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產物的末端結合穩定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。
根據實驗目的選擇適當的引物。常用引物設計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設置。