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用流式細胞術檢測血小板相關抗體

閱讀:665          發布時間:2019-3-18
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一種能夠通過胎盤存在于血小板表面的免疫球蛋白,被稱為血小板相關抗體(PA-IgG)。本實驗來源「實用流式細胞術彩色圖譜」 王書奎、周振英主編。
實驗方法原理    一種能夠通過胎盤存在于血小板表面的免疫球蛋白,被稱為血小板相關抗體(PA-IgG)。
實驗材料    羊 F(ab+)2 2 IgG-PE抗體血樣
試劑、試劑盒    洗滌緩沖液
儀器、耗材    流式細胞儀
實驗步驟    
一、試劑

洗滌緩沖液(PBS/EDTA/BSA),PBS 緩沖液,含 10 mmol/L EDTA 和 0.5% BSA。

抗體:羊 F(ab+)2 抗-人 IgG(Fc Sp)-R-PE(H10104,Caltag 為多克隆抗體)。

陰性對照:羊 F(ab+)2 2 IgG-PE(11304,Caltag)。

二、樣本

正常人血樣 1 份,血小板數值在正常范圍,具體數目不詳。

患者血樣 2 份,為 1 個月齡的雙胞胎患者 1 和患者 2,均為貧血血小板,具體數目不詳。

三、步驟

1. 用含 EDTA 抗凝劑的血液收集管采血,3 個血樣均取 2 ml,分別加到 3 支流式標準管中。

2. 離心 500 r/min,將上清(富血小板血漿)轉到另外 3 支流式標準管中。

3. 離心 2500 r/min 3 min。吸去血漿,用與血漿等體積的洗滌緩沖液重懸血小板。如果必要,可用旋渦混合器混勻。

4. 用洗滌緩沖液洗滌血小板 3 次,每次離心 2500 r/min 3 min。

5. 適量洗滌緩沖液重懸血小板,用血球計數儀測定血小板的濃度,其中正常血樣血小板計數為 2000 /ul,患者 1 的血小板數為 6000 /ul,患者 2 的血小板數為 7000 /ul(稀釋濃度)。

6. 每個含重懸血小板的流式標準管分為兩管。A 管為檢測管,B 管為陰性對照管,共 6 只管。正常人血樣分別取 250 ul 于 2 支 流式標準管(A 管和 B 管)中,每管血小板總數為 5x106。分別取 80 ul 患者 1 的血樣于 2 支流式標準管(A 管和 B 管)中,每管血小板總數為 4.8x106。分別取 70 ul 患者 2 的血樣于 2 支流式標準管(A 管和 B 管)中,每管血小板總數為 4.9x106。

7. 將上述 6 支流式標準管,于 A 管均加 5 ul 羊 F(ab+)2 抗-人 IgG(Fc Sp),B 管均加 5 ul 羊 F(ab+)2 IgG。

8. 室溫,避光孵育 15 min。用洗滌緩沖液再洗 1 次,方法同步驟 4。

9. 去上清,加 0.5 ml 洗滌緩沖液重懸,上機分析。

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