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人 NK T 細 胞 的 分 離 和 擴 增
閱讀：254 發布時間：2019-1-22實驗步驟
基本方案 1 NK T 細胞的鑒定
材 料
外周肝素抗凝血
P B S
R P M I -1640 培養基，含 1 0 % (V /V ) 人血清或 F C S 以 及 10U /m l I L -2 (可選）
流 式 細 胞 緩 沖 液（flow cytometry buffer， FCbuffer) : 含 1 % (v/V ) 人 血 清 、1 % (V / V ) FBS 和 0. 1 % (m /V ) 疊氮鈉的 PBS
熒光素標記的抗 V a 24 單 抗（cloneC15B 2 ， P E 或 FITC 標 記 ， Coulter-Immunotech)
熒光素標記的抗 V p i l 單 抗（clone C 21D 2, P E 或 F I T C 標 記 ， Coulter)
突光素標記的同型對照抗體（BDPharmingen)
突光素標記的抗 6B 1 1 單 抗（B D Pharmingen; 可選）
Cy5 標記的抗 C D 4 單抗、 Cy5 標記的抗 C D 8 單 抗
（BDPhanningen，可選）
熒光素標記的抗 C D 161 單 抗（Coulter，推薦使用）
熒光素標記的其他相關抗體（可選）
含 4 % 甲醛的 PBS (P B S w ith 4 % paraformaldehyde， P F A ) : 配制時置通風櫥中，加熱 至 80°C ， 可攪拌以加速溶解，冷后分裝，一 20°C 保存
0.5m l 微量離心管或 9 6 孔細胞培養板
流式細胞儀
1 . 準備人外周肝素抗凝血（5?10 ml) ，根據情況，室 溫 可 保 存 I d 。 Ficoll-Hypaque 密
基 本 方 案 2 免 疫 磁 珠 法分 離 NK T 細胞及后續擴增
本法可從幾毫升的外周血中分離和擴增 N K T 細 胞（< 1 0 000 N K T 細胞），濃縮白 細 胞（分離血小板時的副產品）也可作為 N K T 細胞的來源。
材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)
外周肝素抗凝血
P B S ，含 2m m o l / L E D T A (附錄 1)
未標記的抗 V 〇 t 2 4 單 抗（Coulter)
未標記的抗 6B 1 1 單 抗 ，即 抗 TCRot 單 抗（B D Pharmingen)
備 選 方 案 I N K T 細胞的流式分選及擴增
附 加 材 料
備 選 方 案 2 NK T 細胞的克隆
附 加 材 料（其 他 材料見基本方案 1 和 2) 1
T 細胞克隆培養基： R P M I -1640，含 1 0 % (W V ) 自體人血清、 20U /m l I L -2 及20U/ml IL-7植物血凝素 (phytohemagglutinin-P ， P H A -P ; Difco)
1.Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法分離 T O M C (單 元 8.1)。取出部分細胞，照射滅活后用作飼養細胞。
2 . 剩余細胞用 P B S 洗滌一遍，加 入 含 1 0 % 人血清的 P B S 重懸細胞，調 整 濃 度 為 IO8個細胞/m l ，冰 浴 15 min。
3 . 加入熒光素標記的抗 V a 2 4 單抗和另一種熒光素標記的抗 V p i l 單 抗（或標記的抗6B 11 單抗，推薦使用），終濃度均為 IOiU g A n U 冰 浴 30 min。同時，取部分細胞加入相應的同型對照抗體。
4 . 在 9 6 孔 圓 底 培 養 板 中 加 入 IO5 照 射 滅 活 后（5000rad) 的 自 體 飼 養 細 胞 和 P H A - P(終 濃 度 2ug/ml) ，補 充 T 細胞克隆培養基至終體積 0.1m l 。同時用流式分選儀分選V a24+ Vpll+ (或 6B 1 1 + ) 雙陽性細胞，分選出的細胞應直接加入上述 9 6 孔板中。
5.—周后，每孔加入 0.1 ml T 細 胞 克 隆 培 養 基（不 含 P H A -P )。顯微鏡下觀察細胞生長情況： 10?M d 后 ，陽性孔中會出現一個或多個母細胞克?。讣毎?圓 形 ，體積較大，每個克隆細胞數超過 100 個）。
6 . 根據克隆生長情況，每 隔 2?3d 用 T 細胞克隆培養基傳代。如果用自體血清進行 T克隆，當細胞擴增后，每次傳代時培養基中增加 2 5 % 的異體人血清或 F B S ，直至*取代自體血清。
7 . 當細胞數量足夠時，用流式細胞儀檢測不同克隆的 V a 2 4 和 Vpll ( 或 6B 1 1 ) 表達情況。
3 ?4 周 后 ，細 胞 可 進 行 二 次 刺 激 ，或 者 在 T 細 胞 克 隆 培 養 基 中 繼 續 培 養 幾 周 。
輔 助 方 案 NK T 細胞的二次刺激和克隆
材 料
4.第 1 天 ，加入重組 IL-2 及 IL-7 各 50U /m l 。
5 . 第 5 天 ，用新鮮培養基進行半量換液，維持各細胞因子濃度為 50U /m l 。
6 . 第 1 0 天 ，在顯微鏡下觀察 T 細胞克隆擴增情況。如果母細胞密度較高且培養基顏色變黃，用含細胞因子的擴增培養基將細胞進行 1 : 2 傳代。對于生長旺盛的細胞，可每 隔 2?3d 進行細胞傳代。
經 過 2 周左右時間細胞可擴增約 1000 倍 。在無追加刺激的情況下，細胞可繼續培養幾周。