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通 過 焚 光 免 疫 細 胞 化 學 分 析 h E S 細 胞
閱讀：206 發布時間：2018-12-29| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.4KB |
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| 資料類型 | PNG 圖片 | 瀏覽次數 | 206次 |
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| 實驗步驟 | 方 案 2. 11 通 過 焚 光 免 疫 細 胞 化 學 分 析 h E S 細 胞 的 特 性 試劑與材料 無菌或無菌制備 □ 生 長 于 0.1 % 明膠包被的玻璃蓋玻片上的h E S 細胞 非無菌 □ 4 % 多聚甲醛 □ P B S A □ T ris-緩 沖 鹽 溶 液（T B S 一） □含有 0.5 % T r i t o n X -100 的 Tris-緩 沖 鹽 溶 液（T B S + ) □ 奶 粉 ， 5 % W /V ，去 離 子 水（d H 20 ) 配制 □ 一抗； S S E A -1、 -3、 -4、 T R A -1-60、 -1-81 及 0 C T -4 □適宜的二抗 □ 封 片 劑 ，如 Fluorosave □吸氣器和吸液管 □鋁箔 □紙板染色盤 □ 可 置 于 2 4 孔板的玻璃蓋玻片 □ 平 板 搖 床（可選擇） □熒光顯微鏡和相機 步驟 第 1 天 (a) h E S 細胞可生長于M E F 伺養層細胞上一起染，因 為 M E F s 不會表達 任 何 hES細胞的標志物。一個24孔板要接種5 X IO5 個經 C 滅 活 的 M E F s ，種 在 0.1 %明膠包被的13m m 玻璃蓋玻片上，如 前 所 述（方 案 2. 5)。 (b ) 在固定之前， h E S 細胞要 傳 代 至 有 M E F 細 胞 的 蓋 玻 片 上 生 長 2?3 天 ，以使細胞貼附并生長成單層，每一種抗體至少要用兩孔h E S 細胞進行染色。 (c) 從生長著 h E S 細胞的蓋玻片上吸去h E S 培養基，用 500W P B S A 洗一次。 (d ) 用 4 % 的多聚甲醒固定30 —— 4 0 m i n 。 (e) 吸去固定液，用 5 0 0 4 P B S A 洗一次。 (f) 每孔加 人 500f i l T B S + , 室 溫 孵 育 15m i n , 放在平板搖床上搖，吸液時要小心 ，不要碰掉細胞。 (g ) 吸去 T B S + , 重 復 步 驟（f) 4?5 遍 ，以保證細胞被*清洗。 T B S + 也使細胞滲透性增加，使抗體染色更充分。 (h ) 清洗結束時，用 500ul 溶 解 于 去 離 子 水 的 5 % 奶 粉 溶 液 孵 育 細 胞 30?60m i n ，以阻斷非特異性的抗體結合。 (i) 在此孵育過程中，根據供應商的提示，用 5 % 奶粉溶液稀釋好一抗。 (j) 吸去奶粉溶液，重 復 洗 的 步 驟（f) 4?5 次 ，已保證除去所有非特異性結合的抗體。 (k ) 每 孔 用 250?500M 1相應的一抗 5 % 奶粉溶液孵育，室溫過夜。放在平板搖床上搖，或者要確認細胞已被浸沒。 注意：加液和吸液時要小心謹慎，以避免抗體的交叉污染。 第 2 天 (a) 吸去一抗溶液，每一種抗體用不同的吸頭以避免交叉污染。 (b ) 用 T B S — 洗細胞，每 孔 500m 1。 (c) 用 T B S 醉育細胞，每 孔 500jlJ , 15m i n ，放在平板搖床上。 (d) 吸 去 T B S ‘ ，重 復 步 驟（c) 4?5 遍 ，以保證除去一抗。 (e) 在清洗孵育過程中，可 用 TBS+ 配制相應 的 二 抗 ，每 孔 需 要 250? 500ul抗體一T B S 1溶液 ，根據是否使用平板搖床來決定加的量（250ul 或 500ul)。 注意：如果使用 D N A 熒光染色顯示核，要在這時閱讀步驟（g )。 (f) 清洗結束時，吸 去 T B S - 溶 液 ，每 孔 加 250?500ul抗體-T B S + 溶液孵育細胞，放在平板搖床上，室溫孵育至少 l h 。 (g ) Hoechst 33258或 D A P I 可用于顯示 h E S 細胞的核，可能要以適宜的濃度加人到二抗溶液中，可與二抗溶液一起孵育。 (h ) 用相應的封片劑封片，如 Fluorosave。 (i) 用熒光顯微鏡和照相設備觀察之前，要讓片子*干燥。 注意：所有 的 二 抗 以 及 用 二 抗 孵育的板都要用鋁箔包 起 來 ， 以 防 被 日 光 漂 白 。 方 案 2. 12 R T -P C R 合 成 h E S 細 胞 的 c D N A 試劑與材料 無菌或無菌制備 □ 幾 小 塊 h E S 細胞集落，按照與常規傳代相同的方法制備（見 2. 5. 1. 2 節 非無菌 □ R N A 提取試劑盒，如 R N A e a s y D 5 X A M V - R T Superscript e n z y m e □ 緩 沖 液 ：含 10m m o l / L M g C l 2 的 A M V - R T □ 引 物 ： oligo (d T )I8, 2ug/ul □ 引 物 ： oligjj C d N >i。， 2ug/ul □ 核 苷 ： d N T P s ， 2m m o l / l □核糖核酸酶抑制劑 ： R N a s i n □ 模 板 ：提 取 的 R N A ， 2ug □ 無 R N A 酶的水 □ 設 置 在 70°C 的加熱塊 □ P C R 熱循環儀 □加樣器和吸頭 □冰 步藤 (a) 使 用 R N A 提取試劑盒，按照制造商的說明書從 h E S 細胞制備 R N A 模板 (b ) 準 備 R T -P C R 的預混液： d N T P s , 2m m o l / L 1ul 方 案 2. 13 通 過 P C R 分 析 h E S 細 胞 的 基 因 表 達 試劑與材料 無菌或無菌制備 □ 幾 小 塊 h E S 細胞集落，按照與常規傳代相同的方法制備（見 2. 5. 1.2 節）。 非無菌 □10XTaq 緩沖液（標準液是 25 mmol/L MgCl2） □ T a g D N A 多聚酶 □ d N T P s ， 2m m o l / L □ R T -P C R 合 成 的 c D N A 模板 □ 高 壓 消 毒 的 d H 20 □瓊脂粉 □溴化乙啶 □ 5 X 上樣染料 i v ) 將一個梳子放人 P C R 膠的模具中，將熱的混合物輕緩地灌人。注意不要產生氣泡，因為氣泡會妨礙 D N A 在膠中的遷移。 V) 拔 梳 前 置 室 溫 30m i n , 使膠冷卻直至凝同，放在電泳 槽 中 ，以 50m m o l / L溴化乙啶緩沖液覆蓋之。 (d ) P C R 循環完成后，將樣品從循環儀中取出。 (e) 每個樣品中加 5M 1 上樣染料，將樣品加至膠中，確認同時加了 肌動蛋白陽性對照樣品以及 D N A 梯形標準品。 (f) 開始電泳， 100V ， 30?40m m , 直 到 D N A 梯形標準品已經清楚地分開，在紫外燈下很容易區分。 (g ) 用 一 個 U V -透 視 器（波 長 315n m ) 看 膠 ，如果需要，用相機拍照。 (h ) 將每一個樣品的所有 D N A 片 段 與 D N A 梯形標準品相比較，觀察是否有預期的 帶（前已述及），（3-肌動蛋白陽性對照樣品也要被證實已經顯示。 (i) 預期大小的 D N A 條帶可以用洗膠試劑盒（如 G E N E C L E A N ® ) 很容易提取出來 ，并且應該通過測序來證實 |
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