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L929細(xì)胞增殖MTT比色法檢測(cè)IL-1的生物活性
閱讀：281 發(fā)布時(shí)間：2018-7-13| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 354.5KB |
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實(shí)驗(yàn)原理
MTT比色法的原理是利用四甲基偶氮唑鹽[3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]在活細(xì)胞線(xiàn)粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，由淡黃色被還原成藍(lán)紫色或藍(lán)黑色的MTT-甲肷，形成的量與活細(xì)胞代謝率及細(xì)胞增殖程度成正相關(guān)。故通過(guò)反應(yīng)細(xì)胞形成的MTT-甲肷量，即可測(cè)定IL-1對(duì)L929細(xì)胞促增殖作用程度，從而間接測(cè)定IL-1的生物活性。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 0.25%胰蛋白酶
2. 10%FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液
3. MTT：用PBS稀釋成5mg/ml，用0.22μm膜過(guò)濾除菌及雜質(zhì)，4℃避光保存。
4. 酸化異丙醇(含0.04mol/L HCl的異丙醇)：100ml異丙醇中加入0.4ml的36% HCl即可。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，刻度吸管，毛細(xì)吸管，加樣器(頭)，刻度離心管，離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡，5%CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，酶標(biāo)測(cè)定儀，570nm與630nm濾光片。
實(shí)驗(yàn)材料
1. 已誘生的IL-1待檢樣品：倍比稀釋成不同濃度。
2. IL-1標(biāo)準(zhǔn)品：倍比稀釋成不同濃度。
3. L929細(xì)胞：作為反應(yīng)細(xì)胞或靶細(xì)胞，存活率應(yīng)>95%。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 將生長(zhǎng)狀況良好的L929細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化2-3min；
2. 將L929細(xì)胞用10%FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，以去除消化液及原生長(zhǎng)培養(yǎng)液；
3. 用10% FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細(xì)胞濃度為2×105/ml；
4. 將L929細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔；
5. 分別加入不同倍比稀釋度的IL-1標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立培養(yǎng)液空白對(duì)照；
6. 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56h；
7. 將96孔培養(yǎng)板取出，各孔加入MTT，10μl/孔；
8. 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h；
9. 取出培養(yǎng)板，先從各孔中輕輕吸出100μl上清液棄去，再加入酸化異丙醇或DMSO，100μl/孔，置室溫10~20min，吹打震蕩，充分混勻，使MTT-甲肷產(chǎn)物充分溶解；
10. 用酶標(biāo)儀以檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm，分別測(cè)定各孔OD值。測(cè)定應(yīng)在酸化異丙醇加入后lh內(nèi)完成。
注意事項(xiàng)
1. L929細(xì)胞存活率應(yīng)>95%，L929細(xì)胞在培養(yǎng)條件不良時(shí)，可呈圓形漂浮狀，此時(shí)更換培養(yǎng)液可使其恢復(fù)為正常的梭形貼壁細(xì)胞。
2. 應(yīng)充分洗滌后加入培養(yǎng)板中，且應(yīng)均勻分散于各孔中，否則可能造成某個(gè)部位細(xì)胞過(guò)密而某個(gè)部位細(xì)胞過(guò)稀，影響細(xì)胞單層形成。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品應(yīng)從1:2開(kāi)始至少6個(gè)倍比稀釋度。
4. 加樣時(shí)，應(yīng)從低濃度到高濃度順序加入，不可共用加樣器頭。
5. 加入酸化異丙醇后，應(yīng)在lh內(nèi)進(jìn)行OD值測(cè)定。
6. 還可按正態(tài)概率紙法或概率單位法計(jì)算IL-1的活性單位。