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本產品是根據探針法qPCR原理開發檢測申克孢子細菌的產品，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA 模板。

2. 根據申克孢子細菌設計引物和探針，能專一性地檢測出申克孢子細菌，但不 能檢測其他非申克孢子細菌。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 本產品只能用于科研。

6. 本產品足夠 50 次體系的熒光定量 PCR。
運輸及保存 自備試劑使用方法低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用本試劑盒提供的陽性對照時，由于其濃度較高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。最好在專門的區域操作。DNA 模板一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

7. 用自選方法純化樣品的DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。

8. 如果有N 個樣品，則需要進行N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。三、設置qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做1 次重復，則標記N+9 個PCR 管，其中N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1 次重復，則標記N+4 個PCR管，其中N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于PCR 陽性對照（用第4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復）： 
四、qPCR 反應參數
過程溫度時間預變性95℃5 minPCR 反應（40 個循環）95℃15sec60℃1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）
 五、數據處理11. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log 值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
 12. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct 必須大于或等于35。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其Ct 大于或等于35 則為陰性，如果小于或等于30 則為陽性。如果在30-35 之間，則重復一次。重復實驗的Ct 值如果大于或等于35 則為陰性，如果小于35，則為陽性。

   申克孢子細菌探針法熒光定量PCR試劑盒