非洲豬瘟病毒實時熒光 PCR 檢測試劑盒使用說明書

 

 

【用途】

本試劑盒采用實時熒光 PCR 方法檢測豬全血、血清、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、扁桃體、肺、肌肉等樣品及環(huán)境樣品中非洲豬瘟病毒（ASFV）的 DNA， 適用于 ASFV 的檢測、診斷和流行病學調(diào)查。

【原理】

提取樣品DNA 作為模板，以引物為起點合成與DNA 模板互補的新鏈，在熱啟動 Taq 酶的作用下， 經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標記的探針與擴增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性， 使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出特異性熒光信號，利用熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號， 根據(jù)樣品Ct 值的大小及擴增曲線的形成情況判定結(jié)果。

【試劑盒組成】

組成	50 頭份	貯藏條件
陰性對照	1 mL	-20℃
陽性對照	600 µL
無菌無核酸酶水	600 µL
PCR 反應液	600 µL
熒光探針	105 µL
說明書	1 份

【需要自備的器材】

1. 試劑：核酸提取試劑。

2. 儀器：離心機、熒光 PCR 擴增儀、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2µL、20µL、200µL、1000µL）。

3. 耗材：熒光 PCR 反應管、吸頭（10µL、200µL 、

1000µL）。

【使用注意事項】

• 建議與世紀元亨提供的柱式 DNA 核酸提取試劑盒配套使用。
• 實驗過程中進行陰性對照和陽性對照樣品的質(zhì)量控制，需進行提取，建議提取用量分別為100µL。
• 所有接觸病料的物品均應合理處置，以免污染實驗室。

4. PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。

• 所有試劑應在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應*融化，8000rpm 離心 15s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20℃。
• 注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效

期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

7. 嚴格遵守操作說明可以獲得好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

8. 反應體系應在特定配液區(qū)或者超凈工作臺中配制，整個實驗過程嚴格控制污染。

9. 反復凍融試劑將降低檢測靈敏度，本試劑盒應在

3 次內(nèi)用完。

【樣品采集】

病死或撲殺豬，取脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、扁桃體、肺、肌肉等；待檢活豬，用注射器取血 5 mL； 或采集與病豬相關場所的糞便、飼料、污水等環(huán)境樣品。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。）

【實時熒光 PCR 操作】

設被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為 N， 則反應體系配制如下：

試劑	體系
無菌無核酸酶水	6.3×（N+1）µL
PCR 反應液	10×（N+1）µL
熒光探針	1.7×（N+1）µL

將以上配制的反應體系充分混勻后，分裝每個反應管中各 18 µL。

分別取 2 µL 模板 DNA，加入相應反應管中， 混勻并作好標記。在熒光 PCR 擴增儀上進行以下反應：95 ℃ 2 min；循環(huán) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40 次，每次循環(huán)的第二步（60 ℃ 35 s）收集熒光信號

（報告基團“FAM”，淬滅基團“None”）。

【結(jié)果判定】

1. 結(jié)果分析條件設定

閾值設定原則：閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的高點。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整。

2. 結(jié)果描述及判定

陽性對照Ct 值＜30 并出現(xiàn)特異的擴增曲線，陰性對照無Ct 值且無特異的擴增曲線，實驗結(jié)果成立。被檢樣品Ct 值＜35 并出現(xiàn)特異的擴增曲線，判為非洲豬瘟病毒核酸陽性；無Ct 值且無特異的擴增曲線， 判為非洲豬瘟病毒核酸陰性；35≤Ct 值＜40 并出現(xiàn)特異的擴增曲線，判為非洲豬瘟病毒核酸疑似，對疑似樣品，需重新取樣提取 DNA，進行復檢，Ct 值＜40 判為陽性，否則判為陰性；對于某些未呈現(xiàn)S 型曲線，但本底較高的樣品，應判定為陰性。

【規(guī)格】50 頭份/盒

【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期為 12

個月。