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技術(shù)文章
構(gòu)巢曲霉探針法熒光定量 PCR 試劑盒
閱讀：325 發(fā)布時(shí)間：2019-9-19產(chǎn)品及特點(diǎn) 構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans.)屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢
科、曲霉屬的一種真菌，分布于糧食、土壤和空氣中。曾用作真菌遺傳學(xué)研究材
料。作為質(zhì)控菌種，可用于水質(zhì)檢測(cè)，化妝品檢測(cè)，食品與藥品檢測(cè)，為大中型
科研提供嚴(yán)格質(zhì)量體系控制的 ATCC,CMCC,CICC,DSMZ 標(biāo)準(zhǔn)菌株。因此快速
檢測(cè)構(gòu)巢曲霉具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開
發(fā)的專門檢測(cè)構(gòu)巢曲霉的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)構(gòu)巢曲霉高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的 DNA
發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震
蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所
得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所
得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個(gè)樣品，設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性
對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000
倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為
PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)真菌 DNA 提取試劑
盒兼容。也可以選購本公司的真菌 DNAout 或柱式真菌 DNAout。本試劑
盒免費(fèi)贈(zèng)送 20 次免 DNA 提取的天凈沙核酸釋放劑，本產(chǎn)品的裂解液可以
直接作為 PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的
N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定
性分析，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào)，其余樣品不變）。
以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)
置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好
后后加）：
成分
樣品管
N+2 個(gè)
PCR 陰性
對(duì)照管
標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
構(gòu)巢曲霉探針法 qPCR 探針 1 μL 1 μL 各 1 μL
構(gòu)巢曲霉探針法 qPCR
引物混合液
2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 個(gè)待測(cè)樣品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
自備超純水 不加 6 μL 不加
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液
（2-7 號(hào)）
不加 不加
各 6μL（2 號(hào)樣到 2
號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)
管…）
11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
過程 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 94℃ 5 min
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
94℃ 0.5 min
55℃
0.5 min（采集 FAM 通道的熒
光信號(hào)）
72℃ 0.5 min
五、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct
值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品
DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大
于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該
小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小
于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct
值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 構(gòu)巢曲霉 LAMP 檢測(cè)試劑盒