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煙曲霉探針法熒光定量 PCR 試劑盒
閱讀：370 發布時間：2019-9-19產品及特點 煙曲霉(Aspergillus fumigatus.)屬殼霉目、杯霉科、煙曲霉屬，是一種重
要的致病菌，也是引起食品的一種真菌。煙曲霉的菌落生長迅速，絨狀或作
一定的絮狀，暗煙綠色，老后色變得更深。此菌嗜高溫，在 45℃或更高的溫度下
生長茂盛。在糧食發熱霉變的中期和后期常大量出現，促進糧溫的升高和敗壞。
煙曲霉能寄生在人、鳥類及其它脊椎動物的肺部引起結核癥。也能侵染棉鈴和蘋
果等，引起果實腐爛，或寄藏于種子上。因此快速檢測煙曲霉具有重要意義。本
產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測煙曲霉的試劑盒，它
具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據煙曲霉高度保守區設計，不會跟其他微生物的 DNA 發
生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。 規格及成分 成分 編號 十孔盒包裝
2×Probe qPCR MagicMix 190303 0.5 mL（本色蓋）
熒光 PCR 模板稀釋液 180701 1 mL（亮黃蓋）
煙曲霉 qPCR 引物 15-26720yw 100 μL（白蓋）
煙曲霉 qPCR 探針 15-26720pb 50 μL（棕色管）
煙曲霉 qPCR 陽性對照
2.0(1×10E8 拷貝/μL)
60908-26720pc 50 μL（黃蓋）
天凈沙核酸釋放劑試用裝 61202 20 次（1mL，綠蓋）
使用手冊 15-26720sc 1 份
運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。 自備試劑 樣品 DNA。 使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由
于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污
染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本
產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，
下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分
震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所
得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所
得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對
照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍
稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為
PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數真菌 DNA 提取試劑盒
兼容。也可以選購本公司的真菌 DNAout 或柱式真菌 DNAout。本試劑盒免費
贈送 20 次免 DNA 提取的天凈沙核酸釋放劑，本產品的裂解液可以直接作為
PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果進行定量分析，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2
個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做定性分析，
則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）。以下只介
紹定量分析的反應設置。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設
置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好
后后加）：
成分
樣品管
N+2 個
PCR陰性對
照管
標準曲線
樣品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
煙曲霉 qPCR 探針 1 μL 1 μL 各 1 μL
煙曲霉 qPCR
引物混合液
2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 個待測樣品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
自備超純水 不加 6 μL 不加
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液
（2-7 號）
不加 不加
各 6μL（2 號樣到 2
號管，3 號樣到 3 號
管…）
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：
過程 溫度 時間
預變性 94℃ 5 min
PCR 反應
（40 個循環）
94℃ 0.5 min
55℃
0.5 min（采集 FAM 通道的熒光
信號）
72℃ 0.5 min
五、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct
值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品
DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大
于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該
小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于
或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如
果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。 關聯產品 煙曲霉 LAMP 檢測試劑盒