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細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之胰酶消化法
閱讀：1086 發(fā)布時(shí)間：2019-9-18實(shí)驗(yàn)方法原理 將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱原代培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)材料 胎鼠新生鼠
試劑、試劑盒 1640培養(yǎng)基牛血清胰酶Hank’s液碘酒
儀器、耗材 培養(yǎng)箱培養(yǎng)瓶青霉素瓶小玻璃漏斗平皿吸管移液管紗布手術(shù)器械血球計(jì)數(shù)板離心機(jī)水浴箱
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank's液可以高壓滅菌。4℃下保存。
二、具體操作
1. 將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。
2. 用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
3. 用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank's液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。
5. 加入3-5 ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
6. 靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7. 1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。
8. 加入Hank's液5 ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。
9. 加入培養(yǎng)液1-2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
10. 將細(xì)胞調(diào)整到5x105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。
收起
注意事項(xiàng)
1. 自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無(wú)菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。
2. 在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過(guò)久，以免溶液蒸發(fā)。
3. 凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。
4. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
5. 點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。
7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。