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實時熒光定量PCR?。?/h3>
閱讀：424 發布時間：2019-9-18
實時熒光定量PCR
一種科學準確的定量方法
實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。
一. 實時熒光定量PCR原理
所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
1. Ct 值的定義
在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。
2. 熒光域值（threshold）的設定
PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
3. Ct值與起始模板的關系
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
4. 熒光化學
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料〔2〕。現將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。
2）SYBR熒光染料：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。
二．內標在傳統定量中的意義
1．幾種傳統定量PCR方法簡介〔3〕：
1）內參照法：
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板〔4〕。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。
擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數〔5〕。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的〔6〕。
2．內標在傳統定量中的作用
由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。
同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
三．內標對熒光定量PCR的影響
1．實時熒光定量PCR無需內標
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性
PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系
由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
2．內標對實時熒光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著〔7,8〕。
但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方〔9〕。
Applied Biosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是*的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域〔10,11,12,13〕。
參考文獻
1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.
2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. B Applied Biosystems
3. 定量聚合酶鏈反應的研究進展與臨床應用. 中華檢驗醫學雜志2000, 23(2): 120-121.
4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reaction. J Pharmacol Toxicol Methods, 1997, 38: 133-140.
5. Wuhu A, Waiztu M, Koch A. A rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriprase (CRT) PCR analysis of cellular genes. Brain Pathol, 1998, 8: 13-18
6. 仝文斌，高巍，費然等. 核酸擴增產物的量化酶免疫通用型檢測方法. 中華醫學檢驗雜志，1999, 22: 83-86.
7. Actor JK, Limor JR, Hunter RL. A flexible bioluminescent-quantitive polymerase reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. J Clin Lab Anal, 1999, 13(1): 40-47.
8. Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR). J Theor Biol, 1997, 184(4): 433-440.
9. Ke LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol. Cell Probes, 2000, 14(2): 127-135.
10. Becker K., D. Pan and C.B.Whitely. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther, 1999, 10: 2559-2566.
11. Higgis, J.A., etal. 5’ nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits. J Clin Microbiol, 1998, 36: 2284-2288.
12. Bieche I., P.Oondy, etal. Real-time reverse transcription-PCR assay for future nagement of ERBB2-based clinical apolications. Clin.Chem, 1999, 45: 1148-1156.
13. Wang X. X. Li, etal. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. 2000,Neurosci.Res, 59(2): 238-46
實時熒光定量PCR
一種科學準確的定量方法
實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。
一. 實時熒光定量PCR原理
所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
1. Ct 值的定義
在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。
2. 熒光域值（threshold）的設定
PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
3. Ct值與起始模板的關系
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
4. 熒光化學
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料〔2〕。現將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。
2）SYBR熒光染料：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。
二．內標在傳統定量中的意義
1．幾種傳統定量PCR方法簡介〔3〕：
1）內參照法：
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板〔4〕。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。
擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數〔5〕。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的〔6〕。
2．內標在傳統定量中的作用
由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。
同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
三．內標對熒光定量PCR的影響
1．實時熒光定量PCR無需內標
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性
PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系
由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
2．內標對實時熒光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著〔7,8〕。
但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方〔9〕。
Applied Biosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是*的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域〔10,11,12,13〕。
參考文獻
1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.
2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. B Applied Biosystems
3. 定量聚合酶鏈反應的研究進展與臨床應用. 中華檢驗醫學雜志2000, 23(2): 120-121.
4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reaction. J Pharmacol Toxicol Methods, 1997, 38: 133-140.
5. Wuhu A, Waiztu M, Koch A. A rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriprase (CRT) PCR analysis of cellular genes. Brain Pathol, 1998, 8: 13-18
6. 仝文斌，高巍，費然等. 核酸擴增產物的量化酶免疫通用型檢測方法. 中華醫學檢驗雜志，1999, 22: 83-86.
7. Actor JK, Limor JR, Hunter RL. A flexible bioluminescent-quantitive polymerase reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. J Clin Lab Anal, 1999, 13(1): 40-47.
8. Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR). J Theor Biol, 1997, 184(4): 433-440.
9. Ke LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol. Cell Probes, 2000, 14(2): 127-135.
10. Becker K., D. Pan and C.B.Whitely. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther, 1999, 10: 2559-2566.
11. Higgis, J.A., etal. 5’ nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits. J Clin Microbiol, 1998, 36: 2284-2288.
12. Bieche I., P.Oondy, etal. Real-time reverse transcription-PCR assay for future nagement of ERBB2-based clinical apolications. Clin.Chem, 1999, 45: 1148-1156.
13. Wang X. X. Li, etal. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. 2000,Neurosci.Res, 59(2): 238-46