一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。 - 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
- 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
- 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備 - 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢?/span>用水作為制備的陰性對照。
- 用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝
三、設置RT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行） - 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。
- 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：
成分 | N+2個制備所得樣品 | RT-PCR陰性對照 | RT-PCR陽性 對照（2-7管） | 2×qRT-PCR 緩沖液 | 10μL | 10μL | 各10μL | 口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各2μL | 50×ROX (見注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL | 樣品制備所得RNA模板（來于第8步） | 5.6μL | 不加 | 不加 | 稀釋所得6個陽性對照（來于第6步） | 不加 | 不加 | 各5.6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） | 10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用ROX染料I的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。 需使用ROX染料II的機型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用ROX的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。 - 上機后按下面參數進行RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。
過程 | 溫度 | 時間 | RT（逆轉錄） | 50℃ | 15-30分鐘 | 預變性 | 94℃ | 2分鐘 | RT - PCR反應 （30個循環） | 95℃ | 15 秒 | 60℃ | 15 秒（采集FAM通道的熒光信號） | 72℃ | 15 秒 | 按儀器預設程序進行溶解曲線分析 |
- 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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