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描述一種大聚合酶鏈反應(PCR)應用的方法，使在已知序列的核心區邊側的未知DNA成幾何級數擴增。用適當的限制性內切裂解含核心區的DNA，以產生適合于PCR 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環狀分子。

PCR的引物同源于環上核心區的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經過環上的未知區而不是分開引物的核心區。 這種反向PCR方法可用于擴增本來就在核心區旁邊的序列，還可應用于制備未知序列探針或測定邊側區域本身的上、下游序列。

引言

通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游兩側的區域，轉位因子的插入位點以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色體載體上 的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體步查(Chromosome walking)所需的噬菌斑雜交或克隆雜交中都十分有用。

要得到邊側序列的探針一般需要進行一系列費時、費力的工作，首先用內切酶裂解和用已知邊側序列的探針Southern雜交以確定大小適合于克隆的末端片段;這些片段還要經過凝膠分離、克隆，得到的物質再與已知邊側區域雜交以確定合適的克隆子。要測定未吞邊側區序列時，通常需要從克隆中進行各種片段的亞克隆。

為避免這些步驟，我們采用擴展的PCR方法，使相鄰邊側區域得以擴增。典型的PCR擴增使用與互補鏈雜交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向內跨過兩個引物之間的區域。

一個引物的DNA合成產物作為另一個引物的模板，進行DNA變性、引物退火，DNA聚合酶管伸反應的多次重復性循環可使引物規定區域的拷貝數成指數增加。

但用傳統PCR方法得不到緊鄰引物外側的DNA序列，因為寡聚核苷酸所引導的既有目的DNA又有引物外側區的DNA合成在拷貝過程中只呈線性增長，這種線性增長是因為，對于每種引物來講，其不能引導DNA反向合成(3'-5')。

幾乎是同時，有三個實驗室分別設計出一種方法，使PCR可以擴增邊側區域。該方法 (反向PCR)的基本點是用適當內切酶裂解核心區外分子，使這些酶切片段自身連接形成環狀分子，從而將邊側區域轉化為內部區域。用與核心區末端同源的引物，但其3'端趄向未知區域，可以進步用PCR擴增環中的未知區域。

反向PCR程序

Ochman等，Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中詳細地描述了反向PCR的不同應用，下面是Ochman等描述的方法概要。

用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環化及反向PCR的片段的末端片段。

能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環化類 型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。

對于擴增左翼或右翼序列，初試時 靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入合適的酶切位點。

用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中，為產生對反向 PCR大小適當的DNA片段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適于連接，環化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。

連接前，需用酚或熱變性使內切酶失活。在我們實驗中，不必裂解環狀分子核心區也可得到有效的PCR擴增。(這顯然 不同于Silver和Keerikatter[7]的實驗結果，他們報道在核心裂解使模板線性化后， PCR擴增率增加100倍，但Triglia[5]等則發現裂解環狀分子與加熱引起隨機缺口效果相同)。

聚合酶鏈反應條件與經典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環。可改變PCR條件以生產特異產物。將反向 PCR用于測序時，與核心區末端后部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部分的核心序列與未知邊側序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。