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技術(shù)文章

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌(大腸埃希氏菌)探針法熒光定量PCR試劑盒

閱讀:419          發(fā)布時間:2019-9-6

產(chǎn)品及特點

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌(ESBL-Escherichia coli)是一種在醫(yī)院內(nèi)感染的常見機會致病菌,各臨床科室以及標本類型中均有檢出,科室分布以普外科為主,標本類型以傷口分泌物標本為主,常引起外殼感染性疾病,該細菌對多種抗生素有較強的耐藥性,所以醫(yī)院要加強對該細菌的耐藥性的檢測與監(jiān)控,積極做好細菌的培養(yǎng)和藥物敏感性試驗,規(guī)范合理使用抗生素,以控制耐藥菌的出現(xiàn)和流行因此快速檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù),本產(chǎn)品就是以染料熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的試劑盒,它具有下列特點:

  • 即開即用,用戶只需要提供樣品DNA模板。
  • 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高
  • 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
  • 特異性高,引物是根據(jù)人超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌高度保守的VP1區(qū)設(shè)計,不會跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
  • 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
  • 本產(chǎn)品只能用于科研

 

規(guī)格及成分

編號

十孔包裝

2×Probe qPCR MagicMix

190303

0.5 mL(本色蓋)

熒光PCR模板稀釋液

180701

1 mL(黃蓋)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌PCR引物

15-66100yw

100 μL(白

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌qPCR探針

15-66100pro

100 μL(棕色管)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌陽性對照2.0

(1×10E8拷貝/μL)

15-66100pc

50 μL(紅

天凈沙DNA釋放劑試用裝

130982

50次(試用裝)

使用手冊

15-66100sc

1份

 

 

運輸及保存

低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月。

 

自備試劑

樣品DNA

 

使用方法

一、稀釋標準曲線樣品(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

  • 標記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
  • 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)
  • 7號管中加入5 μL 10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
  • 換槍頭,在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
  • 換槍頭,在5號管中加入5 μL 10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
  • 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

  • 如果有N個樣品,設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照)一個是NC樣品制備陰性對照)。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟次制備要求的體積一樣以此作為PC另外用水作為NC。
  • 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)細菌DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的細菌DNAout細菌DNAout。本試劑盒免費贈送50次免DNA提取的天凈沙DNA釋放劑,本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為PCR模板,省略了DNA提取步驟。

三、Probe qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進行

  • 如果只做1次重復(fù),則標記N+9個PCR管,其中N+2個于上步得到的N+2個樣品1個用于PCR陰性對照,6個用標準曲線樣品。
  • 標記管中下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋子儲存后后加):

成分

樣品管

N+2

PCR陰性對照管

標準曲線

樣品管(2-7管)

2×Probe qPCR MagicMix(本色蓋)

10 μL

10 μL

各10 μL

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌 qPCR探針(綠

2 μL

2 μL

各2 μL

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌 PCR引物混合液(白

2 μL

2 μL

2 μL

 待測樣品DNA模板

6 μL

不加

不加

第7步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7

不加

不加

6μL(2號樣到2號管,3號樣到3號管

  • 蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行PCR:

過程

溫度

時間

預(yù)變性

94

5 min

PCR反應(yīng)

40個循環(huán))

94

0.5 min

50

0.5 min(采集FAM通道的熒光信號

72℃

0.5 min

后延伸

72

  • min

數(shù)據(jù)處理

  • 以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,推算出其濃度

六、電泳檢測

  • 如果必要電泳確認,可取10-20μL PCR產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實驗環(huán)境,建議不輕易采納。

 

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌可視化LAMP檢測試劑盒

 

 

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